Ίνωση και αυτοφαγία σε χρόνιες ηπατοπάθειες

Abstract

Α. Liver fibrosis. Liver fibrosis has been extensively studied at the cellular and molecular level, but very few data exist on the final enzymatic stages of collagen synthesis (prolyl hydroxylase, PH) and degradation (matrix metalloproteinases, MMPs), particularly in primary biliary cholangitis (PBC). Aim: We studied enzyme activities in liver tissue from patients with chronic liver diseases and compared them to normal livers. 18 patients with PBC of early and late stages (Ludwig’s classification) and seven on treatment with ursodeoxycholate (UDCA) were studied and compared to 34 patients with alcoholic liver disease (ALD), 25 patients with chronic viral liver disease and five normal biopsies. Sera were available from a total of 140 patients. The tritiated water released from the tritiated proline was measured in PH assessment. 14C intact and heat-denatured collagen substrates were used to measure collagenase and gelatinases, respectively. 3H elastin was the substrate for elastase. In serum, Elisas were used for MMP-1, TIMP-1, and TIMP-2 measurements while MMP-2 and MMP-9 were estimated by zymography. PH was significantly increased in early and late PBC. Collagenase was reduced only in the late stages (p<0.01), where the ratio PH/collagenase was increased. UDCA treatment restored values to almost normal. Gelatinases were reduced in late stages (p<0.05). In contrast to PBC and ALD fibrosis, collagen synthesis is not increased in viral fibrosis. The balance shifted towards collagen deposition due to reduced degradation. Interestingly, gelatinolytic activity is not impaired in ALD. Elastase was similar to controls in all diseases studied. TIMP-1 was reduced in early PBC and viral and alcoholic hepatitis and cirrhosis (p<0.001). On the contrary, TIMP-2 was significantly increased in both viral and alcoholic cirrhosis (p<0,0001). No other significant abnormality was found in the other patient groups. Serum MMP-1 was significantly reduced only in late PBC but not in early PBC. Reduction was also found in viral and alcoholic hepatitis and cirrhosis. On the contrary, PBC patients treated with UDCA but also patients with alcoholic fatty liver had normal values. Zymography showed that serum active MMP-2 and MMP-9 were significantly reduced in early and late PBC. Both MMP-2 and MMP-9 were significantly reduced in viral and alcoholic hepatitis and cirrhosis (p<0.0001). On the contrary, patients treated with UDCA and patients with alcoholic fatty liver had near normal values. Viral and alcoholic cirrhosis had similar to normal control values of the MMP-2 pro-enzymes as measured by Elisa in contrast to the active enzyme. Patients treated with UDCA and patients with alcoholic fatty liver on the other hand had increased MMP-9 pro-enzymes in contrast to normal active enzyme values. The present findings indicate that in chronic liver disease, the balance between collagen synthesis and collagen degradation is shifted towards collagen deposition irrespective of the underlying etiology. Increased synthesis is evident even in the early stages of PBC but the collagenolytic system is capable to counteract the increased synthesis, a fact that is lost during the late fibrotic stages of the disease. UDCA treatment, at least partially restores the balance, but further studies are required. New drugs proposed for the treatment of PBC should be checked for their action in the fibrotic enzymes. A similar mechanism was identified in ALD. Interestingly, the shift towards collagen deposition in chronic viral disease is due to suppression of the collagenolytic system and not to increased synthesis. Finally, levels of TIMP-1 are significantly decreased in both viral and alcoholic cirrhosis possibly acting as an additional mechanism to assist ECM degradation. In brief, the following conclusions can be suggested: (1) There is evidence that collagen synthesis increases in the early stages of PBC, but the collagenolytic mechanism may compensate for the increased synthesis. (2) In viral disease, fibrosis may be due to decreased degradation rather than increased synthesis. (3) The final biochemical stages of liver fibrosis may be quantitatively different according to underlying etiology. B. Enzymes related to autophagy Lysosomal enzymes are implicated in autophagy and senescence. Hepatic lysosomal enzymes have not been studied in Primary Biliary Cholangitis (PBC). We therefore quantified the activities of lysosomal hydrolases in liver tissue of PBC patients. We compared enzyme activities in liver tissue from PBC patients with normal livers. Alcoholic liver disease and chronic viral disease served as disease controls. Results: Cathepsin B1 was significantly increased in early PBC (225.1 ± 18.06 mean ± SD, p<0.0001) and reduced in later stages (66.5 ± 9.7, p=0.004, controls 130.4 ± 14.9). It was reduced in patients with extensive fibrosis such as alcoholic and viral cirrhosis (p<0.01 and p=0.004, respectively) but not in chronic hepatitis. Cathepsin D was increased in early PBC (39 × 10³ ± 4.8 SD, p<0.0001) and less so in later stages (20.1 × 10³ ± 3.9, p=0.05, controls 14.1 × 10³ ± 2.9). It was also increased in the presence of histological necro-inflammation in hepatitis. Treatment with ursodeoxycholate (UDCA) restored the abnormal values of enzymes in PBC. Lipid hydrolases mostly paralleled the changes of Cathepsins. Sequential measurements in serum of patients with acute alcoholic hepatitis showed that cathepsin B1 gradually decreases, and esterases increase as aminotransferases improve. The present findings in PBC are compatible with the presence of increased senescence or deranged autophagy or both in agreement with the proposed hypothesis for the pathogenesis of PBC. Most importantly, treatment with UDCA restores the abnormalities of the lysosomal enzymes. In the other chronic liver disease studied, cathepsin B1 activity reduction was associated with advanced fibrosis, while increased cathepsin D activity was associated and possibly was involved in necro-inflammation. Moreover, sequential measurements of cathepsin B and non-specific esterases may be useful as a marker of evolution of liver diseases but this requires additional studies. In brief, the following conclusions can be suggested: 1) The increased activity of lysosomal enzymes in early PBC are possibly on line with increased senescence. 2) Treatment with UDCA restores abnormal values. 3) In chronic liver disease, cathepsin B1 reduction is associated with fibrosis and increased cathepsin D with necro-inflammation. 4) Abnormalities of lysosomal enzymes indicate impairment of the final stage of autophagy in chronic liver disease.

Α. Ένζυμα και αναστολείς σχετιζόμενα με την ίνωση. Η ηπατική ίνωση έχει μελετηθεί εκτεταμένα σε κυτταρικό και μοριακό επίπεδο, αλλά υπάρχουν πολύ λίγα δεδομένα για τα τελικά ενζυμικά στάδια της σύνθεσης και αποδόμησης κολλαγόνου (προλυλ-δροξυλάση-μεταλλοπρωτεϊνάσες), ιδιαίτερα στην Πρωτοπαθή Χολική Χολαγγειϊτιδα (PBC). Στην παρούσα έρευνα μελετήθηκε η ενζυμική δραστικότητα ηπατικών ενζύμων που σχετίζονται με τη σύνθεση και αποδόμηση του κολλαγόνου σε ασθενείς με χρόνιες ηπατοπάθειες. Μελετήθηκαν ηπατικές βιοψίες από 18 ασθενείς με πρώιμα και όψιμα στάδια PBC (Ταξινόμηση κατά Ludwig) και 7 ασθενείς με PBC υπο θεραπεία με ουρσοδεοξυχολικό οξύ (UDCA) όπως και 34 ασθενείς με αλκοολική ηπατοπάθεια και 25 ασθενείς με χρόνια ιογενή ηπατοπάθεια. Τα δεδομένα συγκρίθηκαν με 5 φυσιολογικές βιοψίες. Οροί ήταν διαθέσιμοι από ένα σύνολο 140 ασθενών από τις ίδιες ομάδες ασθενών. Για τον προσδιορισμό της προλυλ-υδροξυλάσης μετρήθηκε η απελευθέρωση νερού σημασμένου με 3Η που παράγεται κατα τη χρησιμοποίηση της 3Η προλίνης στη σύνθεση κολλαγόνου. Πλήρες και θερμικά μετουσιωμένο και σημασμένο με 14C κολλαγόνο, χρησιμοποιήθηκε ως υπόστρωμα για τον προσδιορισμό της κολλαγενάσης και της ολικής γελατινάσης, αντιστοίχως. Για την ελαστάση, το υπόστρωμα ήταν 3H-ελαστίνη. Στον ορό χρησιμοποιήθηκαν Elisa για τη μέτρηση των MMP-1, TIMP-1 και TIMP-2 ενώ για τις MMP-2 και MMP-9 χρησιμοποιήθηκαν η ζυμογραφία για τη μέτρηση των ενεργών ενζύμων και Elisa για τη μέτρηση των προ-ενζυμικών μορφών.Η προλυλ-υδροξυλάση ήταν σημαντικά αυξημένη στην πρώιμη και όψιμη PBC ενώ η κολλαγενάση ήταν μειωμένη μόνο στα όψιμα στάδια (p<0.01). Ομοίως αυξημένη ήταν η προλυλ-υδροξυλάση και στην αλκοολική αλλά όχι στην ιογενή κίρρωση, όπου η ισορροπία τρέπεται προς την ίνωση λόγω μειωμένης αποδόμησης. Ο λόγος προλυλ-υδροξυλάση/κολλαγενάση ήταν αυξημένος στα όψιμα στάδια PBC και στην ίνωση στα άλλα νοσήματα. Η θεραπεία με UDCA είχε αποκαταστήσει τις τιμές σχεδόν στα φυσιολογικά επίπεδα. Οι γελατινάσες ήταν μειωμένες στα όψιμα στάδια PBC (p<0.05) και στην ιογενή κίρρωση αλλά όχι στην αλκοολική ηπατοπάθεια. Η ελαστάση δε διέφερε από τους μάρτυρες σε όλες τις ομάδες. Ο TIMP-1 ήταν μειωμένος τόσο στην πρώιμη PBC όσο και στην ιογενή ηπατίτιδα και κίρρωση (p<0.001). Αντιθέτως, ο TIMP-2 ορού έδειξε στατιστικά σημαντική αύξηση στην ιογενή κίρρωση όπως επίσης και στην αλκοολική κίρρωση (p<0,0001). Δεν παρατηρήθηκε καμία στατιστικά σημαντική μεταβολή μεταξύ των υπολοίπων ομάδων.H MMP-1 ορού έδειξε στατιστικά σημαντική μείωση της δραστικότητας μόνο στην όψιμη PBC και όχι στην πρώιμη PBC. Επιπλέον, η MMP-1 ορού έδειξε στατιστικά σημαντική μείωση της δραστικότητας όχι μόνο στην ιογενή ηπατίτιδα και την ιογενή κίρρωση αλλά και στην αλκοολική ηπατίτιδα και στην αλκοολική κίρρωση Αντιθέτως, η ομάδα υπό UDCA και η ομάδα με AFLD δεν έδειξαν στατιστικά σημαντική μεταβολή της ενζυμικής δραστικότητας.H MMP-2 ορού μετρημένη με τη μέθοδο της ζυμογραφίας έδειξε στατιστικά σημαντική μείωση του ενεργού ενζύμου στην πρώιμη PBC όπως επίσης στην όψιμη PBC (p<0,0001). Επιπλέον, η MMP-2 ορού έδειξε στατιστικά σημαντική μείωση της δραστικότητας όχι μόνο στην ιογενή ηπατίτιδα και στην ιογενή κίρρωση αλλά και στην αλκοολική ηπατίτιδα και στην αλκοολική κίρρωση. Αντιθέτως, η ομάδα υπο UDCA και η ομάδα AFLD δεν έδειξαν στατιστικά σημαντική μεταβολή της ενζυμικής δραστικότητας. Όταν μετρήθηκαν οι προ-ενζυμικές μορφές με Elisa, βρέθηκαν διαφορές στις κιρρωτικές ομάδες όπου τόσο η ιογενής όσο και η αλκοολική κίρρωση δεν έχουν στατιστικά σημαντική διαφορά από τους μάρτυρες εν αντιθέσει με το ενεργό ένζυμο.H MMP-9 ορού με τη μέθοδο της ζυμογραφίας έδειξε στατιστικά σημαντική μείωση της δραστικότητας στην πρώιμη PBC και στην όψιμη PBC. Επιπρόσθετα, η MMP-9 ορού έδειξε στατιστικά σημαντική μείωση της δραστικότητας όχι μόνο στην ιογενή ηπατίτιδα και την ιογενή κίρρωση αλλά και στην αλκοολική ηπατίτιδα και στην αλκοολική κίρρωση (p< 0.0001). Αντιθέτως, η ομάδα υπό UDCA και η ομάδα AFLD δεν έδειξαν στατιστικά σημαντική μεταβολή της ενζυμικής δραστικότητας. Όταν μετρήθηκαν οι προ-ενζυμικές μορφές της ΜΜP-9 με Elisa βρέθηκε ότι οι ασθενείς υπο θεραπεία με UDCA και οι ασθενείς με αλκοολικό λιπώδες ήπαρ έχουν αυξημένα επίπεδα προ-ενζυμικών μορφών αντίθετα με τη μη στατιστικά σημαντική μεταβολή του ενεργού ενζύμου.Τα ευρήματα της μελέτης δείχνουν ότι η ισορροπία μεταξύ σύνθεσης κολλαγόνου και αποδόμησης αυτού ευνοεί την εναπόθεση κολλαγόνου, ανεξαρτήτως της αιτιολογίας των ηπατοπαθειών. Διαπιστώθηκε ότι η σύνθεση αυξάνεται ακόμη και στα πρώιμα στάδια της PBC αλλά το κολλαγονολυτικό σύστημα πιθανότατα αντιρροπεί την αυξημένη σύνθεση. Η αποδόμηση του κολλαγόνου μπορεί να μην αντιρροπεί τη σύνθεση κολλαγόνου στα όψιμα στάδια της PBC. Η θεραπεία της PBC με UDCA μπορεί εν μέρει να αποκαθιστά την ισορροπία, υποδεικνύοντας ότι ενδείκνυται μια προοπτική μακροπρόθεσμη μελέτη. Τα νέα φάρμακα για τη θεραπεία της PBC θα πρέπει να ελεγχθούν για πιθανές επιδράσεις στις ενζυμικές οδούς της ίνωσης. Ένας παρόμοιος μηχανισμός διαπιστώθηκε στην ALD. Ενδιαφέρον αποτελεί ότι η σύνθεση κολλαγόνου δεν αυξάνεται σημαντικά στη χρόνια ιογενή νόσο συγκριτικά με το φυσιολογικό ήπαρ. Ωστόσο, η διαταραχή της ισορροπίας οφείλεται στη σημαντική μείωση του κολλαγονολυτικού μηχανισμού. Σημειωτέων, ότι ο TIMP-1 μειώνεται σημαντικά στην ιογενή και αλκοολική ηπατίτιδα και στην αλκοολική κίρρωση, πιθανότατα δρώντας ως αντιρροπιστικός μηχανισμός για την εξυπηρέτηση της αποδόμησης της ECM.Συνοψίζοντας προκύπτουν τα ακόλουθα συμπεράσματα: 1) Η σύνθεση κολλαγόνου αυξάνεται από τα πρώιμα στάδια της PBC, αλλά ο κολλαγονολυτικός μηχανισμός αντισταθμίζει την αυξημένη σύνθεση. 2) Στις ιογενείς χρόνιες ηπατοπάθειες, η ίνωση οφείλεται στη μειωμένη αποδόμηση κυρίως και όχι τόσο στην αυξημένη σύνθεση. 3) Τα τελικά βιοχημικά στάδια της ηπατικής ίνωσης πιθανόν διαφέρουν ποσοτικά ανάλογα με την αιτιολογία των νόσων. B. Ένζυμα σχετιζόμενα με την αυτοφαγίαΤα λυσοσωμικά ένζυμα, όπως οι όξινες υδρολάσες και λιπάσες, ενέχονται στη διαδικασία των τελικών σταδίων της αυτοφαγίας. Τα ηπατικά λυσοσωμικά ένζυμα έχουν ελάχιστα μελετηθεί στις χρόνιες ηπατοπάθειες και καθόλου στην πρωτογενή χολική χολαγγειϊτιδα (PBC). Στην παρούσα έρευνα μετρήθηκαν οι δραστικότητες λυσοσωμικών υδρολασών και λιπασών στον ηπατικό ιστό χρόνιων ηπατοπαθειών, όπως η αλκοολική ηπατοπάθεια και η χρόνια ιογενής νόσος, ενώ συμπεριελήφθησαν και ασθενείς με πρώιμα και όψιμα στάδια PBC. Η σύγκριση έγινε με ηπατικό φυσιολογικό ιστό. Ως υποστρώματα χρησιμοποιήθηκαν σημασμένη με 14C για την καθεψίνη D, ΒΑΝΑ για την καθεψίνη Β1, ολεϊκή μεθυλαμπελιφερόνη για την όξινη λιπάση και οξική α-ναφθόλη για την όξινη και ουδέτερη εστεράση. Η καθεψίνη Β1 ήταν σημαντικά αυξημένη στην πρώιμη PBC (225.1 ± 18.06 mean ± SD, p<0.0001) και σημαντικά μειωμένη στα όψιμα στάδια της νόσου (66.5 ± 9.7, p=0.004) σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς μάρτυρες (130.4 ± 14.9). Ομοίως μειωμένη ήταν σε ασθενείς με εκτεταμένη ίνωση, όπως η αλκοολική και η ιογενής κίρρωση (p<0.01 και p=0.004, αντιστοίχως), αλλά όχι στη χρόνια ηπατίτιδα. Η καθεψίνη D ήταν αυξημένη στην πρώιμη (39 × 10³ ± 4.8, p<0.0001) και λιγότερο στα όψιμα στάδια (20.1 × 10³ ± 3.9, p=0.05, μάρτυρες 14.1 × 10³ ± 2.9). Ήταν επίσης αυξημένη όταν υπήρχε ιστολογική νεκροφλεγμονή στις ηπατίτιδες. Η θεραπεία με UDCA αποκαθιστούσε τα φυσιολογικά επίπεδα των καθεψινών στην PBC. Οι λιπάσες εμφάνιζαν τις ίδιες μεταβολές με τις καθεψίνες. Διαδοχικές μετρήσεις στον ορό ασθενών με οξεία αλκοολική ηπατίτιδα έδειξαν ότι η καθεψίνη Β1 μειώνεται και οι εστεράσες βαθμιαία αυξάνουν, ακολουθώντας τη βελτίωση των τρανσαμινασών.Τα ευρήματά της παρούσας μελέτης στην PBC πιθανότατα φανερώνουν αυξημένη γήρανση ή διαταραχή της αυτοφαγίας στη νόσο και μπορεί να εξηγούν το συνδυασμό της αυξημένης γήρανσης και αυξημένης απόπτωσης που διαπιστώνεται στην παθογένεια της PBC. Η θεραπεία με UDCA αποκαθιστά τις παθολογικές τιμές των λυσοσωμικών ενζύμων. Στις υπόλοιπες χρόνιες ηπατοπάθειες που χρησιμοποιήσαμε, η μείωση της καθεψίνης B1 φαίνεται να σχετίζεται με προχωρημένη ίνωση ενώ η αυξημένη καθεψίνη D φαίνεται να σχετίζεται και πιθανότατα να εμπλέκεται στην εξέλιξη της νεκροφλεγμονής. Η μέτρηση της καθεψίνης B ορού και των εστερασών μπορεί να αποτελεί χρήσιμο δείκτη εξέλιξης της οξείας ηπατικής νόσου αλλά αυτό απαιτεί περαιτέρω διερεύνηση και επιβεβαίωση.Συνοψίζοντας, τα συμπεράσματα είναι ότι: 1) Η αυξημένη δραστικότητα των λυσοσωμικών ενζύμων στην PBC πιθανόν σχετίζεται με αυξημένη γήρανση ή με διαταραχές της αυτοφαγίας. 2) Η θεραπεία με UDCA αποκαθιστά τις φυσιολογικές τιμές. 3) Η μείωση της καθεψίνης Β1 συνδέεται με την παρουσία ίνωσης στις χρόνιες ηπατοπάθειες, ενώ η αύξηση της καθεψίνης D συνδέεται με τη νεκροφλεγμονή. 4) Οι διαπιστωθείσες ανωμαλίες των λυσοσωμικών ενζύμων υποδηλώνουν διαταραχή των τελικών σταδίων της αυτοφαγίας στις χρόνιες ηπατοπάθειες.