Αποκαλύπτοντας το ρόλο των ιόντων Cu(II) στη νόσο Αlzheimer στοχεύοντας στην υπερφωσφορυλίωση της tau-πρωτεΐνης

Abstract

Alzheimer's Disease (AD) is a chronic neurodegenerative disorder and the leading cause of dementia. One of the hallmark processes of AD is the dissociation of tau protein from microtubules—an essential component of the neuronal cytoskeleton—caused by its hyperphosphorylation. This leads to the accumulation of tau within neurons, forming deposits known as neurofibrillary tangles (NFTs), which contribute to the progressive degeneration and death of neurons. The role of metal ions, particularly the biologically important Cu(II) ion, whose homeostasis is disrupted in AD, has not yet been fully elucidated. Despite tau protein's central role in neurodegeneration, it remains unclear whether Cu(II) directly mediates the formation of NFTs. Recent studies suggest that Cu(II) can efficiently interact with histidine residues (via the imidazole ring) and with the amide nitrogen atoms of peptides. However, unlike the well-characterized Cu(II)-Aβ system, thermodynamic (potentiometric) studies to determine the formation constants of Cu(II)-peptide models of tau protein are limited, and studies involving phosphorylated tau models are entirely lacking. Determining these constants, which reflect the binding strength of the peptide to Cu(II), is essential for understanding how Cu(II) is distributed across various biological processes. To address this gap, phosphorylated (Ser) and non-phosphorylated peptide models of tau were synthesized, targeting different regions of the tau protein (R4 and C-terminus). Their interactions with Cu(II) ions were investigated using potentiometric and spectroscopic techniques (UV-Vis, CD, EPR, and NMR). The complexation pathway observed aligns with that expected for peptides containing histidine in intermediate positions within their sequence. The imidazole nitrogen atom of histidine acts as the primary binding site, followed by sequential deprotonation and coordination of amide donor atoms. In some cases, axial interactions involving carboxylate donor atoms from residues like Aspartic acid (Asp) and Glutamic acid (Glu) were also detected. The presence of phosphate groups and residues like Asp and Glu modulates the peptide's binding affinity for Cu(II) ions depending on pH. For example, in the case of phosphorylated R4 (R4P), coordination of the Ser phosphate group to the equatorial plane of Cu(II) was observed at pH ~6.2. Comparing the binding affinities of Cu(II) to the two peptides (R4 vs. R4P) revealed that phosphorylated R4P had a stronger affinity, with the most significant difference observed at pH 6.2. This suggests that the binding of Cu(II) to the phosphorylated tau could interfere with phosphatase recognition of the modified phosphate group, leading to reduced phosphatase activity and potentially resulting in further tau hyperphosphorylation. Furthermore, the higher binding affinity of Cu(II) to the C-terminus of tau, compared to the R4 region, may promote tau aggregation and hinder Ser396 phosphorylation due to conformational changes. These findings provide valuable insights into the interactions between Cu(II) and tau protein and could contribute to a deeper understanding of the mechanisms by which Cu(II) influences tau pathology in Alzheimer's disease.

Η νόσος Alzheimer (Alzheimer Disease, AD) είναι μια χρόνια νευροεκφυλιστική διαταραχή και η πιο κοινή αιτία άνοιας. Η αποσύνδεση της tau πρωτεΐνης από τους μικροσωληνίσκους — ένα απαραίτητο συστατικό του νευρωνικού κυτταροσκελετού — λόγω της υπερφωσφορυλίωσης της, οδηγεί στη συσσώρευση της μέσα στους νευρώνες, σχηματίζοντας εναποθέσεις γνωστές ως νευροϊνώδη συσσωματώματα (Νeurofibrillary Τangles, NFTs). Το παραπάνω εύρημα είναι ένα από τα χαρακτηριστικά της νόσου Alzheimer, που οδηγεί στη σταδιακή εκφύλιση και θάνατο των νευρώνων. Ο ρόλος των μεταλλικών ιόντων, και ιδιαίτερα του βιολογικά σημαντικού ιόντος Cu(II), του οποίου η ομοιόσταση διαταράσσεται στη νόσο Alzheimer, δεν έχει πλήρως διευκρινιστεί. Παρά τον κρίσιμο ρόλο της tau πρωτεΐνης στο νευροεκφυλισμό, παραμένει ασαφές εάν ο Cu(II) μεσολαβεί στο σχηματισμό των NFTs. Πρόσφατες έρευνες δείχνουν ότι ο Cu(II) μπορεί να αλληλεπιδράσει αποτελεσματικά με ένα κατάλοιπο ιστιδίνης (ιμιδαζολικός δακτύλιος) και με ένα αμιδικό άτομο αζώτου του πεπτιδίου. Ωστόσο, σε αντίθεση με το καλά μελετημένο σύστημα Cu(II)-Aβ, οι θερμοδυναμικές (ποτενσιομετρικές) μελέτες για τον προσδιορισμό της σταθεράς σχηματισμού Cu(II)-πεπτιδικών μοντέλων της tau πρωτεΐνης είναι ελάχιστες, ενώ απουσιάζουν πλήρως σχετικές μελέτες με φωσφορυλιωμένα μοντέλα. Ο προσδιορισμός αυτών των σταθερών, που αντικατοπτρίζουν τη δεσμευτική ισχύ του πεπτιδίου, είναι σημαντικός για την κατανόηση της κατανομής του Cu(II) μεταξύ των διαφόρων βιολογικών διεργασιών. Για να συνεισφέρουμε σε αυτό το πεδίο, πραγματοποιήθηκε σύνθεση φωσφορυλιωμένων (Ser) και μη φωσφορυλιωμένων πεπτιδικών μοντέλων επιλέγοντας διαφορετικές περιοχές της tau πρωτεΐνης (R4, C-τελικό άκρο) και χρήση ποτενσιομετρικών και φασματοσκοπικών (UV-Vis, CD, EPR και NMR) τεχνικών για τη μελέτη της αλληλεπίδρασής τους με τα ιόντα Cu(II). Η πορεία συμπλοκοποίησης είναι η αναμενόμενη για πεπτίδια που περιέχουν το αμινοξύ ιστιδίνη σε ενδιάμεσες θέσεις στην αλληλουχία τους. Το άτομο αζώτου του ιμιδαζολικού δακτυλίου της ιστιδίνης αποτελεί πρωταρχική θέση ένταξης, ακολουθούμενο από τη διαδοχική αποπρωτονίωση και ένταξη αμιδικών (πεπτιδικών) ατόμων δοτών. Σε κάποιες περιπτώσεις ανιχνεύθηκαν και αξονικού τύπου αλληλεπιδράσεις με συμμετοχή κάρβοξυ - ατόμων δοτών (Asp, Glu). Η παρουσία της φωσφορικής ομάδας αλλά και αμινοξικών καταλοίπων όπως Asp, Glu έχει ως αποτέλεσμα την διαφοροποίηση της δεσμευτικής ισχύος των πεπτιδίων έναντι του ιόντος Cu(II) σε συνάρτηση και με την τιμή pH των διαλυμάτων. Στην περίπτωση του R4P, παρατηρείται η ένταξη της φωσφορικής ομάδας της Ser στο ισημερινό επίπεδο του ιόντος Cu(II) (pH~6.2). Η σύγκριση της δεσμευτικής ικανότητας του Cu(II) έναντι των δύο πεπτιδίων (R4-R4P) ανέδειξε το φωσφορυλιωμένο R4P νικητή του ανταγωνισμού, με τη μέγιστη διαφορά να εντοπίζεται σε τιμή pH 6.2. Αυτό πρακτικά θα μπορούσε να οδηγήσει σε μειωμένη ενζυμική δραστικότητα μιας φωσφατάσης καθώς η τελευταία πιθανότατα δεν μπορεί να αναγνωρίζει την διαμορφωτικά τροποποιημένη λόγω ένταξης του Cu(II) φωσφορική ομάδα και κατ’ επέκταση την περιοχή δέσμευσης του μεταλλοϊόντος. Ως αποτέλεσμα αναμένεται η αύξηση του επιπέδου φωσφορυλίωσης της tau (υπερφωσφορυλίωση). Από την άλλη, η αυξημένη δεσμευτική ικανότητα του Cu(II) στο C-τελικό άκρο της tau σε σχέση με την R4 περιοχή, μπορεί να ευνοήσει τη συσσωμάτωση και να αναστείλει τη φωσφορυλίωση της Ser396 λόγω διαμορφωτικών αλλαγών. Τα παραπάνω αποτελέσματα αναμένεται να ρίξουν φως στην αλληλεπίδραση μεταξύ του Cu(II) και της tau πρωτεΐνης, συμβάλλοντας στην κατανόηση των μηχανισμών που εμπλέκουν το ιόν Cu(II) και την tau στη νόσο Alzheimer.