Ανίχνευση και χαρακτηρισμός καρκινο-ειδικών Τ λεμφοκυττάρων σε ασθενείς με πολλαπλούν μυέλωμα

Abstract

Multiple Myeloma (MM) is a relatively rare malignant neoplasm characterized by uncontrolled proliferation of clonal plasma cells in the bone marrow that leads to overproduction of non-functional immunoglobulins (IG). In B lymphocyte malignancies, including MM, clonotypic rearrangements of immunoglobulin genes lead to the expression of unique, novel peptides that can act as neoantigens. Consequently, B cell receptors (BcR) represent a source of antigenic targets with implications for disease-specific immune responses and therapeutic interventions. In recent years, much evidence has accumulated for the complex crosstalk between MM plasma cells and T cells. However, neither the nature nor the role of antigens interacting with the MM clone in the selection and activation of autologous T cells has been elucidated. The main characteristic of T cells in MM is exhaustion and senescence, probably as a result of chronic antigenic stimulation. In this context, in this PhD thesis, we performed immunogenetic characterization of the immunoglobulin gene repertoire in subgroups of patients with IgA versus IgG MM as well as detection and characterization of carcinoma-specific T lymphocytes in patients with MM. The first part of the study investigated potential differences in the immunogenetic profiles of IgA versus IgG MM in a large cohort of patients, focusing on the distinct features of specific IGH genes, topology and other molecular features of SHM and the VH CDR3 region. A notable novel finding of the present study concerned differences in SHM profiles in certain subgroups of IgA versus IgG MM cases expressing immunoglobulin with the same IGHV gene. We also observed a characteristic predominance of specific IGHV genes and selective association of some of them with certain IGHD and IGHJ genes in IgG versus IgA MM. In the second part of the PhD thesis, phenotypic and immunogenetic characterization of T cells in patients with MM was performed, focusing on exploring the possibility that the rearrangements of immunoglobulin genes lead to the expression of unique, peptide sequences that can serve as neoantigens for T cells in MM. We observed a characteristic distribution of T cell subpopulations in the bone marrow characterized by a significant increase in executive versus memory T cells and, at the same time, increased levels of apoptosis and exhaustion markers of T cells in the bone marrow of patients with MM. Furthermore, the oligoclonal expansions of CD4+ and, in particular, CD8+ T cells in MM that are more pronounced in bone marrow (at least for CD4+ T cells) argue in favor of selection by antigens localized in the bone marrow, a claim further supported by the significant differences in the relative frequency of dominant clonotypes in marrow versus blood. Finally, a significant number of potential class I/II T lymphocyte neoepitopes were identified, contained in the clonotypic immunoglobulin of patients with MM, whose immunogenicity was confirmed by ex vivo experiments. In conclusion, the present study provides evidence supporting the role of stimulation and antigen selection in the pathogenesis of the disease. Moreover, it supports the hypothesis of the presence of T cells specific against MM plasma cells in the bone marrow microenvironment, which carry functional defects that limit their cytotoxic activity, leading to an unsuccessful immune response.

Το Πολλαπλούν Μυέλωµα (ΠΜ) είναι σχετικά σπάνιο κακοήθες νεόπλασμα των Β λεµφοκυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος το οποίο χαρακτηρίζεται από ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό κλωνικών πλασματοκυττάρων στο μυελό των οστών που οδηγεί σε υπερπαραγωγή μη λειτουργικών ανασοσφαιρινών (IG). Στις κακοήθειες των Β λεμφοκυττάρων, συμπεριλαμβανομένου και του ΠΜ, οι κλωνοτυπικές αναδιατάξεις των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών οδηγούν στην έκφραση μοναδικών, νέων πεπτιδίων που μπορεί να δράσουν ως νεοαντιγόνα. Συνεπώς, οι υποδοχείς των Β λεμφοκυττάρων (ΒκΥ) συνιστούν πηγή αντιγονικών στόχων με προεκτάσεις για νοσο-ειδικές άνοσες απαντήσεις και θεραπευτικές παρεμβάσεις. Τα τελευταία χρόνια έχουν συσσωρευθεί πολλές ενδείξεις για την περίπλοκη στιχομυθία μεταξύ των ΠΜ πλασματοκυττάρων και των T λεμφοκυττάρων. Ωστόσο, δεν έχει αποσαφηνιστεί ούτε η φύση ούτε ο ρόλος των αντιγόνων που αλληλεπιδρούν με τον ΠΜ κλώνο στην επιλογή και την ενεργοποίηση των αυτόλογων Τ λεμφοκυττάρων. Κύριο χαρακτηριστικό των Τ λεμφοκυττάρων στο ΠΜ είναι η εξάντληση και η γήρανση, πιθανότατα ως αποτέλεσμα χρόνιας αντιγονικής διέγερσης. Σε αυτό το πλαίσιο, στην παρούσα διδακτορική διατριβή πραγματοποιήθηκε ανοσογενετικός χαρακτηρισμός του ρεπερτορίου των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών σε υποομάδες ασθενών με IgA έναντι IgG ΠM καθώς και ανίχνευση και χαρακτηρισμός καρκινο-ειδικών Τ λεμφοκυττάρων σε ασθενείς με ΠΜ. Στο πρώτο μέρος της μελέτης διερευνήθηκαν πιθανές διαφορές στα ανοσογενετικά προφίλ του IgA έναντι του IgG ΠM σε ένα μεγάλο σύνολο ασθενών, δίνοντας έμφαση στα διακριτά χαρακτηριστικά συγκεκριμένων γονιδίων IGH, στην τοπολογία και τα άλλα μοριακά χαρακτηριστικά της ΣΥΜ και της περιοχής VH CDR3. Ένα αξιοσημείωτο νέο εύρημα της παρούσας μελέτης αφορούσε τις διαφορές του προφίλ της ΣΥΜ σε ορισμένες υποομάδες περιπτώσεων IgA έναντι IgG ΠΜ που εξέφραζαν ανοσοσφαιρίνη με το ίδιο γονίδιο IGHV. Επίσης, παρατηρήθηκε χαρακτηριστική επικράτηση συγκεκριμένων γονιδίων IGHV και επιλεκτική συσχέτιση ορισμένων από αυτά με ορισμένα γονίδια IGHD και IGHJ στο IgG έναντι του IgA ΠM. Στο δεύτερο μέρος της διδακτορικής διατριβής, πραγματοποιήθηκε φαινοτυπικός και ανοσογενετικός χαρακτηρισμός των Τ λεμφοκυττάρων σε ασθενείς με ΠΜ, εστιάζοντας στις αναδιατάξεις των γονιδίων της ανοσοσφαιρίνης που οδηγούν στην έκφραση μοναδικών, πεπτιδικών αλληλουχιών ικανών να λειτουργήσουν ως νεοαντιγόνα. Παρατηρήθηκε χαρακτηριστική κατανομή των υποπληθυσμών των Τ λεμφοκυττάρων στο μυελό των οστών που χαρακτηρίζεται από σημαντική αύξηση των εκτελεστικών έναντι των Τ λεμφοκυττάρων μνήμης και, συγχρόνως, ανιχνεύθηκαν αυξημένα επίπεδα δεικτών απόπτωσης και εξασθένησης των Τ λεμφοκυττάρων στο μυελό των οστών των ασθενών με ΠΜ. Οι ολιγοκλωνικές εκπτύξεις των CD4+ και, ιδίως, των CD8+ Τ λεμφοκυττάρων στο ΠΜ που είναι πιο έντονες στο μυελό (τουλάχιστον για τα CD4+ Τ λεμφοκύτταρα) συνηγορούν υπέρ της επιλογής από αντιγόνα που εντοπίζονται στο μυελό των οστών, ένας ισχυρισμός που υποστηρίζεται περαιτέρω από τις σημαντικές διαφορές στη σχετική συχνότητα των κυρίαρχων κλωνοτύπων στο μυελό έναντι του αίματος. Τέλος, εντοπίστηκε σημαντικός αριθμός πιθανών νεοεπιτόπων Τ λεμφοκυττάρων τάξης Ι/ΙΙ που περιέχονται στην κλωνοτυπική ανοσοσφαιρίνη ασθενών με ΠΜ, η ανοσογονικότητα των οποίων επιβεβαιώθηκε με ex vivo πειράματα. Συμπερασματικά, η παρούσα μελέτη προσφέρει στοιχεία που υποστηρίζουν το ρόλο της διέγερσης και της επιλογής από αντιγόνο στην παθογένεια του ΠΜ. Επίσης, ενισχύει την υπόθεση παρουσίας Τ λεμφοκυττάρων ειδικών εναντίον των ΠΜ πλασματοκυττάρων στο μικροπεριβάλλον του μυελού των οστών, τα οποία φέρουν λειτουργικές βλάβες που περιορίζουν την κυτταροτοξική τους δράση, οδηγώντας σε μία ανεπιτυχή άνοση απάντηση.