Περίληψη
Στο Κεφάλαιο 1 της παρούσας διδακτορικής διατριβής γίνεται μία σύντομη ιστορική αναδρομή για τις πρώτες εφαρμογές των ενζύμων στη βιομηχανία. Στη συνέχεια αναφέρονται οι προκλήσεις που υπάρχουν στη βιομηχανία για τους βιοκαταλύτες και αναλύονται οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για την προσαρμογή τους σε βιομηχανικές διεργασίες. Εστιάζοντας στη (μετα)γονιδιωματική προσέγγιση, γίνεται αναφορά στη βιοπληροφορική ανάλυση που ακολουθείται για την ανακάλυψη νέων γονιδίων που κωδικοποιούν ένζυμα με ιδιαίτερα χαρακτηριστικά. Έπειτα, γίνεται μία γενική εισαγωγή για το προς μελέτη πεδίο έρευνας, την επεξεργασία της θαλάσσιας βιομάζας των φυκών, όπου δίνονται πληροφορίες για τη σύσταση των φυκών και των εφαρμογών τους στη βιομηχανία. Στη συνέχεια, αναλύονται οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για τον εξευγενισμό της βιομάζας φυκών και δίνονται πληροφορίες για τα ένζυμα τροποποίησης πολυσακχαριτών. Κλείνοντας το κεφάλαιο παρατίθεται ο στόχος της διατριβής, η ταυτοποίηση και ο χαρακτηρισμός ενζύμων δ ...
Στο Κεφάλαιο 1 της παρούσας διδακτορικής διατριβής γίνεται μία σύντομη ιστορική αναδρομή για τις πρώτες εφαρμογές των ενζύμων στη βιομηχανία. Στη συνέχεια αναφέρονται οι προκλήσεις που υπάρχουν στη βιομηχανία για τους βιοκαταλύτες και αναλύονται οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για την προσαρμογή τους σε βιομηχανικές διεργασίες. Εστιάζοντας στη (μετα)γονιδιωματική προσέγγιση, γίνεται αναφορά στη βιοπληροφορική ανάλυση που ακολουθείται για την ανακάλυψη νέων γονιδίων που κωδικοποιούν ένζυμα με ιδιαίτερα χαρακτηριστικά. Έπειτα, γίνεται μία γενική εισαγωγή για το προς μελέτη πεδίο έρευνας, την επεξεργασία της θαλάσσιας βιομάζας των φυκών, όπου δίνονται πληροφορίες για τη σύσταση των φυκών και των εφαρμογών τους στη βιομηχανία. Στη συνέχεια, αναλύονται οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για τον εξευγενισμό της βιομάζας φυκών και δίνονται πληροφορίες για τα ένζυμα τροποποίησης πολυσακχαριτών. Κλείνοντας το κεφάλαιο παρατίθεται ο στόχος της διατριβής, η ταυτοποίηση και ο χαρακτηρισμός ενζύμων δραστικών σε πολυσακχαρίτες από θαλάσσιο μικροβίωμα με ακραίες συνθήκες περιβάλλοντος. Στο Κεφάλαιο 2 αναφέρονται τα πρωτόκολλα για τη βιοπληροφορική ανάλυση και τις πειραματικές τεχνικές μοριακής βιολογίας, μικροβιολογίας και ενζυμολογίας που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα διατριβή. Στο Κεφάλαιο 3 περιγράφεται η βιοπληροφορική ανάλυση που ακολουθήθηκε για την ταυτοποίηση μιας νέας λυάσης αλγινικού από μεταγονιδιωματικές βιβλιοθήκες από τις υδρόθερμες πηγές του ηφαιστείου Kolumbo στο Αιγαίο Πέλαγος, που ονομάστηκε από την ερευνητική μας ομάδα Kolumbo Alginate Lyase (KΑlLy). Η ανάλυση της αλληλουχίας και ο βιοχημικός χαρακτηρισμός της KΑlLy έδειξαν ότι είναι μια λυάση πολυσακχαριτών με μόνο 58% ταυτότητα με γνωστές αλληλουχίες, ανήκει στην οικογένεια λυασών πολυσακχαριτών 7 (PL7) με ενδο- και εξω- δράση σε αλγινικό και πολυ-μαννουρονικό οξύ, με υψηλή δραστικότητα στους 60°C (56 ± 8 U/mg) και υψηλή θερμοσταθερότητα (χρόνος ημίσειας ζωής 30 h στους 50°C). Η ανάλυση της μεθοδολογίας απόκρισης επιφάνειας (RSM) έδειξε ότι οι βέλτιστες συνθήκες αντίδρασης με υπόστρωμα το πολυ-μαννουρονικό οξύ είναι 44°C, pH 5.5, σε 440 mM NaCl. Αυτή η νέα λυάση αλγινικού είναι μια πολύτιμη προσθήκη στην εργαλειοθήκη των ενζύμων τροποποίησης αλγινικού, λόγω της διαφορετικής αλληλουχίας και της καλής θερμικής σταθερότητάς της, ενώ λόγω της διαφοράς αλληλουχίας της από τα ήδη χαρακτηρισμένα ένζυμα της κατηγορίας, επιτρέπει την ανακάλυψη νέων PL7 ενζύμων. Στο Κεφάλαιο 4 περιγράφεται η βιοπληροφορική ανάλυση που ακολουθήθηκε για την ταυτοποίηση νέων β-γλουκανασών από μεταγονιδιωματικές βιβλιοθήκες από τις υδρόθερμες πηγές του ηφαιστείου Kolumbo στο Αιγαίο Πέλαγος, που ονομάστηκαν από την ερευνητική μας ομάδα Kolumbo β-glucanases (KolG). Η ανάλυση αλληλουχίας των KolGs έδειξε ότι αυτές οι νέες β-γλουκανάσες παρουσιάζουν χαμηλή ταυτότητα με γνωστές αλληλουχίες (28-56%) και ανήκουν στην οικογένεια γλυκοζιδικών υδρολασών 16 (GH16). Η έκφραση αυτών των γονιδίων για την παραγωγή διαλυτών πρωτεϊνών απαιτούσε τη σύντηξή τους με την πρωτεΐνη δέσμευσης μαλτόζης (MBP) και ο βιοχημικός χαρακτηρισμός των συντηγμένων πρωτεϊνών έδειξε πως τα ένζυμα έχουν ενδο- και εξω- δράση σε πολυσακχαρίτες γλυκόζης, όπως β-γλουκάνη από κριθάρι, λαμιναρίνη και λειχενάνη, με δραστικότητα σε pH 5.0-9.0, στους 40-50°C (0.4-4.0 U/mg) και σε υψηλές συγκεντρώσεις NaCl (1-4 M). Αυτές οι νέες β-γλουκανάσες λόγω της σημαντικά διαφορετικής αλληλουχίας τους από τις ήδη χαρακτηρισμένες, της σταθερότητάς τους σε υψηλές συγκεντρώσεις NaCl και του εύρους των υποστρωμάτων πολυσακχαριτών που αποικοδομούν, θα μπορούσαν να αποτελέσουν πολύτιμα εργαλεία για την τροποποίηση β-γλουκανών από χερσαίους και θαλάσσιους οργανισμούς.
περισσότερα
Περίληψη σε άλλη γλώσσα
In Chapter 1 of this thesis, a brief historical review of the introduction of enzymes in industry is given. Then, the challenges in industry for biocatalysts and the methods to adapt enzymes to industrial processes are presented. Focusing on the (meta)genomic approach for identifying new enzymes with unique features, the bioinformatics analysis that is commonly followed for this purpose is discussed. Moreover, a general introduction to the field of research under investigation, the bioprocessing of marine algal biomass, is made, and information on the composition of algae and their applications in industry is given. The methods used to refine algal biomass are then discussed and information on polysaccharide modifying enzymes is given. The chapter concludes with the aim of the thesis, the identification and characterization of carbohydrate active enzymes from marine microbiome of extreme environmental conditions. In Chapter 2, the protocols about the bioinformatic analysis and the expe ...
In Chapter 1 of this thesis, a brief historical review of the introduction of enzymes in industry is given. Then, the challenges in industry for biocatalysts and the methods to adapt enzymes to industrial processes are presented. Focusing on the (meta)genomic approach for identifying new enzymes with unique features, the bioinformatics analysis that is commonly followed for this purpose is discussed. Moreover, a general introduction to the field of research under investigation, the bioprocessing of marine algal biomass, is made, and information on the composition of algae and their applications in industry is given. The methods used to refine algal biomass are then discussed and information on polysaccharide modifying enzymes is given. The chapter concludes with the aim of the thesis, the identification and characterization of carbohydrate active enzymes from marine microbiome of extreme environmental conditions. In Chapter 2, the protocols about the bioinformatic analysis and the experimental procedures of molecular biology, microbiology and enzymology techniques that were conducted are presented. In Chapter 3, the bioinformatic analysis followed to identify a new alginate lyase from metagenomic libraries from the hydrothermal vents of the Kolumbo volcano in the Aegean Sea, named from our group Kolumbo Alginate Lyase (KAlLy) is described. The sequence analysis and biochemical characterization of KAlLy showed that this enzyme is a polysaccharide lyase with only 58% identity to known sequences, belonging to the Polysaccharide Lyase family 7 (PL7) with endo- and exo- activity on alginate and poly-mannuronic acid, with high activity at 60°C (56 ± 8 U/mg) and high thermostability (half-life time of 30 h at 50°C). The analysis of response surface methodology (RSM) revealed that the optimal reaction conditions using poly-mannuronic acid as substrate are 44°C, pH 5.5, with 440 mM NaCl. This novel alginate lyase is a valuable addition to the toolbox of alginate modification enzymes owe to its good thermal stability, while it significantly expands the sequence pool of PL7 enzymes, due to its sequence difference to the known enzymes of this category. In Chapter 4 the bioinformatic analysis followed to identify novel β-glucanases from metagenomic libraries constructed from the hydrothermal vents of the Kolumbo volcano in the Aegean Sea, named from our group KolG (Kolumbo β-glucanases) is described. The sequence analysis of KolGs showed that these β-glucanases show low identity to known sequences (28-56%) and belong to the Glycosyl Hydrolases family 16 (GH16). Expression of these genes for the production of soluble proteins required their fusion with the maltose binding protein (MBP). The biochemical characterization of the fused proteins showed that the enzymes have endo- and exo-activity on glucose polysaccharides, such as barley β-glucan, laminarin and lichenan, with activity at pH range 5.0-9.0, at 40-50°C (0.4-4.0 U/mg) and at high NaCl concentrations (1-4 M). These new β-glucanases, due to their diverse sequence, their stability at high NaCl concentrations and the range of polysaccharide substrates they can degrade, could be valuable tools for modifying β-glucans from terrestrial and marine organisms.
περισσότερα