Design of nanomaterials for oligonucleotide detection

Abstract

Nanoparticles are considered a powerful tool for novel applications ranging from imaging and sensing to therapy. In this thesis, gold nanoparticles functionalised with DNA strands were used for the detection of target oligonucleotides in live cells while upconversion nanoparticles functionalised with DNA strands were used for the detection of target oligonucleotides in a tube. Gold nanoparticles functionalised with synthetic DNA oligonucleotides were used to identify and sort skeletal stem cells upon specific mRNA detection. Human bone marrow stromal cells include a population of skeletal stem cells, with the capacity to differentiate along the osteogenic, adipogenic, and chondrogenic lineages. According to current techniques, the isolation and enrichment of skeletal stem cells from human tissues face challenges when there is no specific skeletal stem cell marker. DNA functionalised AuNPs were able to detect skeletal stem cells based on endocellular mRNA expression and to rapidly sort these cells from human bone marrow. This is a significant approach for tissue engineering as skeletal stem cells can be harnessed to help bone regeneration. The enhancement of the endosomal escape of DNA functionalised gold nanoparticles via the incorporation of a cell-penetrating peptide has been studied in order to maximize the concentration of gold nanoparticles that can detect mRNA and therefore reduce their total amount when incubating with cells. Two different approaches for the functionalisation of gold nanoparticles’ surfaces with peptides are presented. In the first case, gold nanoparticles were functionalised with thiol terminated DNA strands followed by functionalisation with cysteine terminated cell-penetrating peptides. In the second instance, the peptide was conjugated on the 5’ end of the DNA strand. Then, the gold nanoparticles were modified with these conjugate sequences. All the above probes exhibited similar stability towards degradation by endocellular enzymes and similar specificity towards the detection of specific mRNA targets. Finally, the fabrication of an oligonucleotide sensor was developed based on the emissive optical properties of oligonucleotide-coated lanthanide-doped upconversion nanoparticles and the quenching ability of two-dimensional materials; MoS₂, WS₂ and graphene oxide. In the first system, it was investigated the development of an upconversion nanoparticles sensor that detected polyA sequences and used the two-dimensional materials, MoS₂ and WS₂, as quenchers. In the second system, the fabrication of a DNA sensor for SARS-CoV-2 oligonucleotide detection was demonstrated while in this case, graphene oxide was the quencher. In both cases, monodisperse upconversion nanoparticles were functionalised with single-stranded DNA. In the presence of a complementary oligonucleotide target and the formation of double-stranded DNA, the upconversion nanoparticles could not interact with two-dimensional materials, thus retaining their fluorescence properties. The high sensitivity and specificity of this sensor to detect specific target oligonucleotides were also monitored.

Τα νανοσωματίδια αποτελούν ένα ισχυρό εργαλείο για νέες εφαρμογές, που εκτείνονται από την απεικόνιση και την ανίχνευση έως και τη θεραπεία. Στην παρούσα διατριβή χρησιμοποιήθηκαν νανοσωματίδια χρυσού λειτουργικοποιημένα με αλληλουχίες DNA για την ανίχνευση στοχευμένων ολιγονουκλεοτιδίων σε ζωντανά κύτταρα, ενώ upconversion νανοσωματίδια, επίσης λειτουργικοποιημένα με DNA, χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση στοχευμένων ολιγονουκλεοτιδίων in vitro. Τα λειτουργικοποιημένα νανοσωματίδια χρυσού με συνθετικά DNA ολιγονουκλεοτίδια χρησιμοποιήθηκαν για την αναγνώριση και τη διαλογή σκελετικών βλαστοκυττάρων μέσω της ανίχνευσης συγκεκριμένων μορίων mRNA. Τα ανθρώπινα στρωματικά κύτταρα του μυελού των οστών περιλαμβάνουν έναν πληθυσμό σκελετικών βλαστοκυττάρων με ικανότητα διαφοροποίησης προς τις οστεογενείς, λιπογενείς και χονδρογενείς σειρές. Ωστόσο, με τις διαθέσιμες τεχνικές, η απομόνωση και ο εμπλουτισμός αυτών των κυττάρων είναι δύσκολα, καθώς δεν υπάρχει συγκεκριμένος δείκτης ταυτοποίησής τους. Τα νανοσωματίδια χρυσού λειτουργικοποιημένα με DNA κατάφεραν να ανιχνεύσουν σκελετικά βλαστοκύτταρα με βάση την ενδοκυτταρική έκφραση mRNA και να τα διαχωρίσουν γρήγορα από τον ανθρώπινο μυελό των οστών. Η προσέγγιση αυτή είναι ιδιαίτερα σημαντική για τη μηχανική ιστών, καθώς τα σκελετικά βλαστοκύτταρα μπορούν να αξιοποιηθούν για την προώθηση της οστικής αναγέννησης. Παράλληλα, διερευνήθηκε η ενίσχυση της διαφυγής από τα ενδοσώματα των λειτουργικοποιημένων με DNA νανοσωματιδίων χρυσού μέσω της ενσωμάτωσης ενός πεπτιδίου, με σκοπό να αυξηθεί η συγκέντρωση των νανοσωματιδίων που φτάνουν στο κυτταρόπλασμα για την ανίχνευση mRNA και, κατά συνέπεια, να μειωθεί η συνολική ποσότητα τους που απαιτείται κατά την επώαση με κύτταρα. Παρουσιάζονται δύο διαφορετικές στρατηγικές λειτουργικοποίησης των νανοσωματιδίων με πεπτίδια. Στην πρώτη περίπτωση, τα νανοσωματίδια χρυσού λειτουργικοποιήθηκαν αρχικά με αλληλουχίες DNA και στη συνέχεια με πεπτίδια. Στη δεύτερη περίπτωση, το πεπτίδιο συζεύχθηκε στο 5’ άκρο της αλληλουχίας DNA και κατόπιν τα νανοσωματίδια τροποποιήθηκαν με τις συζευγμένες αλληλουχίες. Και οι δύο προσεγγίσεις εμφάνισαν παρόμοια σταθερότητα έναντι της ενζυμικής αποδόμησης εντός των κυττάρων και παρόμοια εξειδίκευση για την ανίχνευση συγκεκριμένων στόχων mRNA. Τέλος, αναπτύχθηκε ένας αισθητήρας ολιγονουκλεοτιδίων βασισμένος στις οπτικές ιδιότητες των upconversion νανοσωματιδίων λειτουργικοποιημένων με ολιγονουκλεοτίδια και στην ικανότητα απόσβεσης των δισδιάστατων υλικών, όπως MoS₂, WS₂ και οξειδίου του γραφενίου. Στο πρώτο σύστημα διερευνήθηκε η ανάπτυξη ενός αισθητήρα με upconversion νανοσωματίδια για την ανίχνευση polyA αλληλουχιών, χρησιμοποιώντας τα δισδιάστατα υλικά MoS₂ και WS₂ για απόσβεση. Στο δεύτερο σύστημα παρουσιάστηκε η κατασκευή ενός DNA αισθητήρα για την ανίχνευση ολιγονουκλεοτιδίων του SARS-CoV-2, όπου χρησιμοποιήθηκε οξείδιο του γραφενίου για απόσβεση. Και στα δύο συστήματα, τα upconversion νανοσωματίδια λειτουργικοποιήθηκαν με μονόκλωνο DNA. Παρουσία συμπληρωματικού στοχευμένου ολιγονουκλεοτιδίου και σχηματισμού δίκλωνου DNA, τα νανοσωματίδια δεν μπορούσαν πλέον να αλληλεπιδράσουν με τα δισδιάστατα υλικά, διατηρώντας έτσι τις φθορίζουσες ιδιότητές τους. Η υψηλή ευαισθησία και εξειδίκευση του αισθητήρα στην ανίχνευση συγκεκριμένων ολιγονουκλεοτιδίων καταγράφηκε.