Ο ρόλος των ριβοσωμάτων και της πρωτεϊνοσύνθεσης στη μετανάστευση ενδοθηλιακών και καρκινικών κυττάρων με στόχο την ανάδειξη καινοτόμων αντικαρκινικών φαρμακολογικών παρεμβάσεων

Abstract

Pleiotrophin (PTN) is a secreted protein that regulates angiogenesis and various types of cancer, through its tyrosine phosphatase receptor PTPRZ1. In glioblastoma, PTN levels have been associated with an increased risk of recurrence and low survival rates. Unpublished preliminary data have suggested the involvement of PTN in protein synthesis, possibly through its interaction with ribosomal proteins and translation -related factors, as well as its presence within isolated ribosomes. Based on these findings, this dissertation investigated the potential role of PTN in ribosome function/biogenesis and translation regulation. In this study, a direct interaction of PTN with eEF1A was confirmed, as well as its presence in ribosomes under conditions that could support its role as a ribosomal protein. However, such characterization requires further research. PTN has been found in both ribosomal subunits, in two distinct forms with different molecular weights, while both forms are present in polysomes. The absence of PTN does not seem to affect ribosome biogenesis in specimen isolated from Ptn+/+ and Ptn-/- mice or the rate of translation in liver tissue isolated from Ptn+/+ and Ptn-/- mice. Nevertheless, differences were observed in the morphology of the endoplasmic reticulum and the number of free ribosomes between Ptn+/+ and Ptn-/- endothelial cells, suggesting the involvement of PTN in translation regulation. Treatment of endothelial cells with PTN induces protein synthesis through mTORC1 kinase activation, a phenomenon inhibited by the mTORC1 inhibitor rapamycin. Additionally, rapamycin appears to inhibit PTN-induced migration of endothelial cells. Increased mTORC1 activation and translation rate were observed in Ptprz1-/- endothelial cells and rapamycin effectively eliminated the difference in the proliferation and migratory potential between Ptprz1-/- and Ptprz1+/+ cells. Since the c-Met inhibitor crizotinib also inhibited the enhanced angiogenic potential of Ptprz1-/- compared to Ptprz1+/+ endothelial cells, the involvement of c-Met in PTN-induced TORC1 signaling was investigated. Genetic depletion of PTPRZ1 or deactivation of PTPRZ1 phosphatase domain following PTN binding, leads to increased c-Met phosphorylation, enhanced mTORC1 activation, and increased translation. Inhibition of either c-Met or VEGFR2 tyrosine kinase eliminated the PTN-induced mTORC1 activation and translation, suggesting the involvement of both tyrosine kinase receptors in the signaling pathway. Finally, ανβ3 integrin, a receptor necessary for PTN-induced cell migration, appeared to be involved in the mTORC1 activation, as the use of the selective integrin αvβ3 antibody LM609 led to mTORC1 activation, increased protein synthesis, and c-Met phosphorylation. A PTN peptide corresponding to the region through which it interacts with integrin αvβ3 exhibited similar activity to LM609 antibody, suggesting that binding to this integrin is significant. Although the mechanism activated by the integrin binding remains unknown, these observations propose a possible mechanism that helps explain the failure of integrin inhibitors as anti- angiogenic/anti-cancer drugs in clinical settings. In summary, this dissertation suggests a new potential role of PTN in regulating ribosome function and identifies a novel signaling pathway of PTN downstream of PTPRZ1 and αvβ3, that involves the activation of c-Met and mTORC1, leading to increased protein synthesis.

Η πλειοτροπίνη (pleiotrophin, PTN) είναι μια εκκρινόμενη πρωτεΐνη με ρυθμιστικές δράσεις που αφορούν στην αγγειογένεση και σε διάφορους τύπους καρκίνου, μέσω του υποδοχέα της PTPRZ1. Στο γλοιοβλάστωμα, τα επίπεδα της ΡΤΝ έχουν συνδεθεί με αυξημένη πιθανότητα υποτροπής και χαμηλή πιθανότητα επιβίωσης. Προκαταρτικά αποτελέσματα υπέδειξαν την εμπλοκή της ΡΤΝ στην πρωτεϊνοσύνθεση, μέσω της πιθανής αλληλεπίδρασής της με ριβοσωματικές πρωτεΐνες και παράγοντες που εμπλέκονται στη μετάφραση, καθώς και τον εντοπισμό της σε ίζημα απομονωμένων ριβοσω μάτων. Στηριζόμενοι στα παραπάνω δεδομένα, στην παρούσα διατριβή έγινε διερεύνηση του πιθανού ρόλου της ΡΤΝ στη λειτουργία/βιογένεση του ριβοσώματος και στη ρύθμιση της μετάφρασης. Στην παρούσα εργασία επιβεβαιώθηκε η άμεση αλληλεπίδραση της ΡΤΝ με τον eEF1A, καθώς και η παρουσία της στο ριβόσωμα, υπό συνθήκες τέτοιες που θα μπορούσαν να υποστηρίξουν το ρόλο της ως ριβοσωματική πρωτεΐνη. Ωστόσο, ένας τέτοιος χαρακτηρισμός απαιτεί επιπλέον μελέτες. Η ΡΤΝ εντοπίστηκε και στις δυο ριβοσωματικές υπομονάδες, σε δυο διακριτές μορφές με διαφορετικά μοριακά βάρη, ενώ στα πολυσώματα ήταν παρούσες και οι δυο μορφές της. Η απουσία της ΡΤΝ δε φαίνεται να επηρεάζει τη βιογένεση του ριβοσώματος σε δείγματα προερχόμενα από μύες Ptn+/+ και Ptn-/-, ούτε τον ρυθμό της μετάφρασης σε ήπατα από μύες Ptn+/+ και Ptn-/-. Εντοπίζονται, όμως, διαφορές στη μορφολογία του ενδοπλασματικού δικτύου και στον αριθμό των ελεύθερων ριβοσωμάτων μεταξύ των Ptn+/+ και Ptn-/- ενδοθηλιακών κυττάρων, οδηγώντας στην υπόθεση για εμπλοκή της ΡΤΝ στη ρύθμιση της διαδικασίας της μετάφρασης. Η εξωγενώς χορηγούμενη ΡΤΝ επάγει τη διαδικασία της πρωτεϊνοσύνθεσης σε ενδοθηλιακά κύτταρα, μέσω ενεργοποίησης της κινάσης mTORC1, φαινόμενο που αναστέλλεται από τον αναστολέα της mTORC1, ραπαμυκίνη. Παράλληλα, η ραπαμυκίνη φαίνεται να αναστέλλει την επαγόμενη από ΡΤΝ μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων. Στην προσπάθεια εντοπισμού του υποδοχέα μέσω του οποίου η ΡΤΝ ενεργοποιεί την mTORC1, διαπιστώθηκε αυξημένη ενεργοποίηση της mTOR και αυξημένος ρυθμός μετάφρασης στα Ptprz1-/- ενδοθηλιακά κύτταρα. Η ραπαμυκίνη εξαλείφει τη διαφορά στη μεταναστευτική ικανότητα και στον ρυθμό πολλαπλασιασμού μεταξύ των Ptprz1-/- και των Ptprz1+/+ κυττάρων. Δεδομένης της δράσης του αναστολέα του c-Met, κριζοτινίμπης, στον φαινότυπο των Ptprz1+/+ και Ptprz1-/- ενδοθηλιακών κυττάρων, η οποία μας είναι γνωστή από προηγούμενη διατριβή, ελέγχθηκε η ύπαρξη του c-Met καθοδικά των δράσεων της ΡΤΝ και ανοδικά της mTORC1. Βρέθηκε ότι γενετική αποσιώπηση του PTPRZ1 ή απενεργοποίηση της φωσφατάσης του PTPRZ1 μετά από αλληλεπίδραση με την ΡΤΝ, οδηγεί σε αύξηση της φωσφορυλίωσης του c-Met, αυξημένη ενεργοποίηση της mTORC1 και αύξηση της μετάφρασης, ενώ αναστολή είτε του c-Met ή είτε του VEGFR2 εξαλείφουν την επαγόμενη από ΡΤΝ ενεργοποίηση της mTOR και της μετάφρασης, υποδηλώνοντας την εμπλοκή και των δυο υποδοχέων κινασών τυροσίνης στο σηματοδοτικό μονοπάτι. Τέλος, η ιντεγκρίνη β3 είναι υποδοχέας απαραίτητος για την επαγωγική δράση της ΡΤΝ στην κυτταρική μετανάστευση και φαίνεται να εμπλέκεται και στην ενεργοποίηση της mTORC1, καθώς η χρήση του εκλεκτικού έναντι της ιντεγκρίνης ανβ3 αντισώματος LM609 οδηγεί σε ενεργοποίηση της mTORC1, αύξηση της πρωτεϊνοσύνθεσης και αύξηση της φωσφορυλίωσης σε τυροσίνη του c-Met. Ένα πεπτίδιο της ΡΤΝ που αντιστοιχεί στην περιοχή μέσω της οποίας η ΡΤΝ αλληλεπιδρά με την ιντεγκρίνη ανβ3, έχει παρόμοια δράση με την ΡΤΝ και το αντίσωμα LM609 στην ενεργότητα του c-Met και της mTORC1, υποδηλώνοντας ότι η δέσμευση στην ιντεγκρίνη ανβ3 είναι σημαντική, χωρίς να είναι γνωστός ο μηχανισμός που ενεργοποιείται καθοδικά της δέσμευσης. Επιπλέον, το αποτέλεσμα αυτό προτείνει έναν πιθανό μηχανισμό που εξηγεί την αποτυχία των αναστολέων των ιντεγκρινών ως αντι-αγγειογενετικών/αντικαρκινικών φαρμάκων στην κλινική. Συνοψίζοντας, η παρούσα διατριβή παρέχει παρατηρήσεις που υποστηρίζουν μια νέα πιθανή δράση της ΡΤΝ στη ρύθμιση της λειτουργίας των ριβοσωμάτων και ταυτοποιεί ένα νέο σηματοδοτικό μονοπάτι της ΡΤΝ καθοδικά του υποδοχέα PTPRZ1 και της ιντεγκρίνης ανβ3 που περιλαμβάνει την ενεργοποίηση του c-Met και της mTORC1, οδηγώντας σε ενεργοποίηση της πρωτεϊνοσύνθεσης.