Study of the role of tumor microenvironment in adenoid cystic carcinoma

Abstract

Introduction: Adenoid cystic carcinoma (AdCC) is a rare, slow-growing salivary gland malignancy that relapses frequently. Despite the recent progress in the understanding of the pathobiology of the disease, little information exists regarding the impact of tumor anatomic subsite on gene expression, tumor immune microenvironment (TIME) composition, overall (OS) and disease-specific survival (DSS) and response to treatment. Aiming to address this knowledge gap, we developed a comprehensive pipeline that included the use of an in-house cohort of AdCC samples, RNA sequencing datasets from AdCC and normal salivary glands and a public clinical database of patients diagnosed with AdCC. Materials and methods: To investigate gene expression differences and compare the TIME between anatomic locations of AdCC, we used 87 samples, including 48 samples (27 AdCC and 21 normal salivary gland tissue samples) from 4 publicly available AdCC RNA sequencing datasets, and a validation set of 39 samples from an in-house cohort (30 AdCC and 9 normal salivary gland samples). RNA sequencing data were used for single sample gene set enrichment analysis (ssGSEA) and TIME deconvolution. Quantitative PCR (qPCR) and multiplex immunofluorescence (mIF) were performed on the in-house cohort. Wilcoxon rank-sum, nonparametric equality-of-medians tests and linear regression models were used to evaluate tumor subsite differences. To further explore the role of anatomical location on survival and response to treatment, we extracted demographic, treatment, and survival data from the Surveillance, Epidemiology, and End Results (SEER) database. The associations between tumor characteristics and aRT with OS and DSS were estimated using hazard ratios (HR) and 95% confidence intervals (CI).Results: AdCCs of different anatomic subsites (i.e. parotid, submandibular, sublingual and minor salivary glands) differed with respect to expression of several key tumorigenic pathways. The reactive oxygen species (ROS)/NRF2 pathway signature was significantly underexpressed in submandibular versus other major gland AdCCs (i.e. parotid, sublingual) versus other major gland AdCCs, while this was not the case among normal glands (i.e. submandibular vs. parotid vs. sublingual) normal glands. Additionally, the NRF2 pathway, whose expression was found to be positively associated with overall survival, was overexpressed in parotid gland AdCCs compared to minor and submandibular gland AdCCs. TIME deconvolution identified differences in CD4+ T cell populations between major and minor gland AdCC, and natural killer (NK) cells between minor, submandibular and parotid gland AdCCs. Meanwhile, normal submandibular glands were enriched in plasma cells compared to other normal gland controls. Submandibular gland AdCCs had the worst prognosis (adjusted DSS HR = 1.48; 95% CI = 0.99-2.20, compared to parotid), and this difference was more pronounced among patients with advanced-stage tumors (adjusted DSS HR = 1.93; 95% CI = 1.13-3.30). aRT was associated with increased overall survival only among stage III submandibular AdCC patients (HR = 0.64; 95% CI = 0.42-0.98) and had no benefit in any other group. Conclusions: Our data reveal key molecular differences between AdCC tumors of different anatomic subsites and identified that submandibular gland AdCC carries a worse prognosis than other gland subsites and may benefit from aRT. ROS and NRF2 pathways are underexpressed in submandibular and minor gland AdCCs compared to parotid, and NRF2 pathway expression is positively associated with survival. CD4+ T, NK cell, and plasma cell populations also vary by tumor subsite, suggesting that the submandibular AdCC tumor-intrinsic pathway differences observed may be responsible for influencing TIME composition and survival differences associated with these tumors.

Εισαγωγή: Το αδενοειδές κυστικό καρκίνωμα (ΑΚΚ) αποτελεί έναν σπάνιο και εξαιρετικά βραδέως εξελισσόμενο καρκίνο των σιελογόνων αδένων, ο οποίος χαρακτηρίζεται συχνά από τοπικές υποτροπές και απομακρυσμένες μεταστάσεις. Παρά τις πρόσφατες προόδους στην κατανόηση της παθοβιολογίας της νόσου, υπάρχουν εξαιρετικά περιορισμένες πληροφορίες σχετικά με την επίδραση της τοποθεσίας του όγκου στη γονιδιακή έκφραση, τη σύσταση του άνοσο-μικροπεριβάλλοντος του όγκου (ΑΜΠΟ), τη συνολική (ΣΕ) και τη νόσο-ειδική επιβίωση (ΝΕΕ) και την ανταπόκριση στη θεραπεία. Με στόχο να συνεισφέρει στην κατανόηση της σχέσης αυτής, στην παρούσα διατριβή αναπτύχθηκε ένα ερευνητικό προτόκολλο το οποίο περιλαμβάνει τη χρήση κλινικών δειγμάτων ΑΚΚ, δεδομένων μεταγραφομικής από ΑΚΣ και φυσιολογικούς σιελογόνους αδένες, και μια κλινική βάση δεδομένων με περιστατικά ΑΚΚ. Ασθενείς και μέθοδοι: Για τη διερεύνηση των διαφορών στην έκφραση των γονιδίων και τη σύγκριση του μικροπεριβάλλοντος του όγκου (ΑΜΠΟ) μεταξύ των ανατομικών τοποθεσιών του ΑΚΚ, χρησιμοποιήσαμε 87 δείγματα, συμπεριλαμβανομένων 48 δειγμάτων (27 ΑΚΚ και 21 φυσιολογικούς ιστούς σιελογόνων αδένων) από 4 σύνολα δεδομένων μεταγραφομικής (RNA sequencing) του ΑΚΚ, και μια ομάδα 39 δειγμάτων σιελογόνων αδένων (30 ΑΚΚ και 9 δείγματα φυσιολογικούς ιστούς σιελογόνων αδένων). Τα δεδομένα μεταγραφομικής (RNA sequencing) χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση εμπλουτισμού γονιδίων (single sample gene set enrichment analysis- ssGSEA) και βιοπληροφορική αναλυση ποσοτικού προσδιορισμού του ΑΜΠΟ. Στην ομάδα δειγμάτων σιελογόνων αδένων πραγματοποιήθηκε ποσοτική ανάλυση PCR (qPCR) και ο πολλαπλός ανοσοφθορισμός (multiples Immunofluorescence - mIF). Για την αξιολόγηση των διαφορών στην ανατομική θέση του όγκου χρησιμοποιήθηκαν τα μη παραμετρικά τεστ: Wilcoxon rank-sum, μη παραμετρικά τεστ ισότητας μέσων και μοντέλα linear regression.Αποτελέσματα: Τα ΑΚΚ σε διαφορετικές ανατομικές θέσεις (δηλαδή παρωτίδα, υπογνάθιος, υπογλώσσιος και ελάσσονες σιελογόνοι αδένες) διέφεραν ως προς την έκφραση αρκετών βασικών μονοπατιών της καρκινογένεσης. Η υπογραφή του μονοπατιού ελευθέρων ριζών (ROS)/παράγοντα πυρηνικού υποδοχέα NRF2 ήταν σημαντικά υποεκφρασμένη στα ΑΚΚ του υπογναθίου σε σύγκριση με άλλους μείζονες αδένες (δηλαδή παρωτίδα, υπογλώσσιο αδένα), ενώ αυτό δεν ίσχυε στους φυσιολογικούς αδένες. Επιπλέον, το μονοπάτι NRF2, το οποίο βρέθηκε να συσχετίζεται θετικά με τη συνολική επιβίωση, υπερεκφραζόταν στα ΑΚΚ της παρωτίδας σε σύγκριση με τους ελάσσονες και τους υπογνάθιους αδένες. Η ανάλυση του ΑΜΠΟ έδειξε διαφορές στις πληθυσμούς CD4+ T λεμφοκυττάρων μεταξύ ΑΚΚ μείζονων και ελασσόνων αδένων, και κυττάρων φυσικών φονέων (NK) μεταξύ ΑΚΣ ελασσόνων, υπογναθίου και παρωτίδας. Παράλληλα, οι φυσιολογικοί υπογνάθιοι αδένες ήταν εμπλουτισμένοι σε πλασματοκύτταρα, συγκριτικά με τους υπόλοιπους φυσιολογικούς αδένες. Τα ΑΚΚ του υπογναθίου αδένα παρουσίασαν τη χειρότερη πρόγνωση (adjusted HR για NEE = 1,48; 95% CI = 0,99-2,20, σε σύγκριση με την παρωτίδα), και αυτή η διαφορά ήταν μεγαλύτερη μεταξύ των ασθενών με όγκους προχωρημένου σταδίου (adjusted HR για ΝΕΕ = 1,93; 95% CI = 1,13-3,30). Η ακτινοθεραπεία συσχετίστηκε με αυξημένη συνολική επιβίωση μόνο μεταξύ των ασθενών με ΑΚΣ του υπογναθίου σταδίου III (HR = 0,64; 95% CI = 0,42-0,98) και δεν είχε κανένα όφελος σε οποιοδήποτε άλλο στάδιο. Συμπεράσματα: Τα δεδομένα της παρούσας μελέτης αποκαλύπτουν βασικές μοριακές διαφορές μεταξύ των ΑΚΚ εντοπιζόμενου σε διαφορετικές θέσεις και επιπρόσθετα ότι τα ΑΚΚ του υπογναθίου αδένα παρουσιάζουν χειρότερη πρόγνωση από τους άλλους αδένες και έχουν το μέγιστο όφελος από την επικουρική ακτινοθεραπεία. Τα μονοπάτια ROS και NRF2 υποεκφράζονται σε ΑΚΚ του υπογναθίου και των ελασσόνων σιελογόνων αδένων σε σύγκριση με τον παρωτίδα, ενώ η έκφραση του μονοπατιού NRF2 σχετίζεται θετικά με την επιβίωση. Οι πληθυσμοί των CD4+ T, NK κυττάρων και πλασματοκυττάρων διαφέρουν επίσης ανά ανατομική θέση του όγκου, υποδεικνύοντας ότι οι διαφορές στις μοριακά μονοπάτια που παρατηρούνται στους όγκους του του υπογναθίου μπορεί να επηρεάζουν τη σύνθεση του ΑΜΠΟ και να σχετίζονται και τις διαφορές στην επιβίωση που παρατηρούνται σε αυτούς τους όγκους.