Κυτταρικές, σηματοδοτικές και μεταβολικές τροποποιήσεις στη λοίμωξη από τον ιό της ηπατίτιδας C: ταυτοποίηση κυτταρικών στόχων που εμπλέκονται στην ανάπτυξη/εξέλιξη ηπατικού καρκίνου

Abstract

Hepatitis C is a viral disease with a global geographical distribution and is one of the most important public health problems. It is currently estimated that 58 million people are carriers of Hepatitis C virus (HCV). Chronicity is established in 60-80% of HCV-infected individuals, accompanied by an increased risk for cirrhosis development within the next 20 years. At least 2-7% of cirrhotic patients develop hepatocellular carcinoma (HCC) annually. Reprogramming of host lipid metabolism is crucial for the progression of HCV-induced liver disease even after treatment with direct-acting antivirals (DAAs) in cirrhotic patients. The angiopoietin-like proteins -3 and -4 (ANGPTL-3 and ANGPTL-4) are important regulators of the host lipid metabolism, as they increase plasma lipids through inhibition of lipoprotein (LPL), hepatic (HL) and endothelial (LIPG) lipases. The aim of this thesis was to investigate the interactions between ANGPTLs and HCV before and after DAAs treatment in vivo and in vitro, and to examine the contribution of ANGPTLs in the deregulation of host lipid metabolism and the establishment / progression of viral infection. Previous studies from our laboratory showed a significant decrease in ANGPTL-3 gene expression during HCV infection in vitro. To investigate this phenomenon in depth, we constructed hepatic cell lines overexpressing both ANGPTL-3 and ANGPTL-4, in order to delineate possible ANGPTL-mediated mechanisms of viral infection inhibition. Specifically, we investigated the effects of ANGPTL overexpression on the host lipid metabolism and any putative influence exerted on the viral life cycle. Our results showed that under conditions of ANGPTL overexpression, a partial inhibition of the enzymatic activity of hepatic lipase (HL) was observed, accompanied by a decrease in the endogenous levels of hepatic triglycerides, probably due to reduced lipid uptake from the liver through HL, as well as a decrease in the number of lipid droplets-triglyceride store, albeit at different levels, pronounced in the case of ANGPTL-3. In contrast to ANGPTL-4, infection of ANGPTL-3 cell line with the HCV-2a and HCV-3a viral strains failed to reverse the observed decreases in the tested parameters of hepatic lipid metabolism, although HCV has been shown to increase hepatic lipogenesis. Notably, HCV viral replication was found to be significantly reduced upon ANGPTL-3 overexpression, but recovered following exogenous administration of recombinant apolipoprotein E (apoE). Subsequently, we investigated the expression of the ANGPTLs in HCV clinical samples throughout the natural progression of HCV infection and in long-term infections in vitro, before and after treatment with DAAs. ANGPTL-3 levels were found to be statistically reduced in HCV patients with advanced fibrosis, as compared to other disease stages, while ANGPTL-4 levels were progressively increased from acute infection to cirrhosis and HCC. In vitro experiments showed that only ANGPTL-3 mRNA was down-regulated during early infection, while both ANGPTLs were increased later. Treatment with DAAs did not alter ANGPTL-3 levels in advanced fibrosis/cirrhosis and in the in vitro HCV clearance model, which we developed in the laboratory, in contrast to ANGPTL-4. Finally, we observed a correlation between the key profibrotic factor TGF-β and ANGPTLs that strengthens the observed reciprocal relationship between ANGPTLs and hepatic fibrosis. Overall, we observed differential expression of the ANGPTL-3 and ANGPTL-4 lipid regulators during HCV infection and treatment. In fact, ANGPTL-3 appears to be part of the “molecular fingerprint” left by HCV after its DAA-mediated eradication that could contribute to persistent dysregulation of lipid metabolism in “cured” individuals and predispose to HCC development. The identification of such mechanisms helps to better understand the HCV life cycle and the pathobiology of HCV-associated liver disease and could potentially contribute to the development of innovative therapies.

Η Ηπατίτιδα C είναι μια ιογενής νόσος με παγκόσμια γεωγραφική κατανομή και αποτελεί ένα από τα σημαντικότερα προβλήματα δημόσιας υγείας. Σήμερα υπολογίζεται ότι περίπου 58 εκατομμύρια άτομα είναι φορείς του ιού της Ηπατίτιδας C (Hepatitis C virus, HCV). Σε ποσοστό 60-80% των περιπτώσεων η νόσος μεταπίπτει σε χρόνια με αυξημένο κίνδυνο ανάπτυξης κίρρωσης του ήπατος σε βάθος χρόνου 20 ετών, ενώ τουλάχιστον 2-7% των κιρρωτικών ασθενών αναπτύσσουν ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (ΗΚΚ) ετησίως. Ο επαναπρογραμματισμός του μεταβολισμού των λιπιδίων του ξενιστή είναι ζωτικής σημασίας για την πρόοδο της ηπατικής νόσου που επάγεται από τον HCV ακόμα και μετά από θεραπεία με αντι-ιικά άμεσης δράσης (Direct-acting antivirals, DAAs) σε ασθενείς με κίρρωση. Οι ομοιάζουσες της αγγειοποιητίνης πρωτεΐνες (Angiopoietin-like proteins, ANGPTLs) ANGPTL-3 και ANGPTL-4, είναι σημαντικοί ρυθμιστές του λιπιδικού μεταβολισμού, καθώς αυξάνουν τα λιπίδια του πλάσματος μέσω αναστολής της δραστικότητας των ενζύμων λιποπρωτεϊνική (LPL), ηπατική (HL) και ενδοθηλιακή λιπάση (LIPG). Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν να ελεγχθεί αφενός η αλληλεπίδραση των ANGPTLs και του HCV πριν και μετά τη θεραπεία με DAAs in vivo και in vitro και αφετέρου να εξεταστεί η συμβολή των ANGPTLs στην απορρύθμιση του λιπιδικού μεταβολισμού του ξενιστή και στην εγκαθίδρυση και εξέλιξη της ιικής μόλυνσης. Προηγούμενη μελέτη του εργαστηρίου μας έδειξε σημαντική μείωση της γονιδιακής έκφρασης της ANGPTL-3 στη διάρκεια της HCV μόλυνσης in vitro. Για την εις βάθος διερεύνηση του φαινομένου, κατασκευάσαμε ηπατικές κυτταροσειρές υπερέκφρασης τόσο της ANGPTL-3 όσο και της όμορης πρωτεΐνης ANGPTL-4, ώστε να ελεγχθούν πιθανοί μηχανισμοί παρεμπόδισης της ιικής μόλυνσης από τις ANGPTLs και συγκεκριμένα παράμετροι που επηρεάζουν τον κυτταρικό λιπιδικό μεταβολισμό με αποτέλεσμα να επηρεάζεται η ολοκλήρωση του ιικού κύκλου ζωής. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν πως σε συνθήκες υπερέκφρασης των ANGPTLs παρατηρήθηκε αναστολή της ενζυμικής ενεργότητας της HL, μείωση των ενδογενών επιπέδων των ηπατικών τριγλυκεριδίων, πιθανόν λόγω μειωμένης εισόδου λιπιδίων από την κυκλοφορία μέσω της HL, καθώς και μείωση του αριθμού των λιποσταγονιδίων – αποθηκών των τριγλυκεριδίων, αν και σε διαφορετικά επίπεδα από την κάθε ANGPTL πρωτεΐνη. Σε αντίθεση με την ANGPTL-4, η μόλυνση της ANGPTL-3 κυτταροσειράς με τα ιικά στελέχη HCV-2a και HCV-3a δεν κατάφερε να αναστρέψει τις παρατηρούμενες μειώσεις στις δοκιμαζόμενες παραμέτρους του ηπατικού λιπιδικού μεταβολισμού, αν και ο HCV έχει δειχθεί ότι αυξάνει την ηπατική λιπογένεση. Επιπλέον, ο ιικός αναδιπλασιασμός βρέθηκε σημαντικά μειωμένος στην υπερέκφραση της ANGPTL-3, ενώ τα επίπεδά του επανήλθαν μετά από εξωγενή χορήγηση ανασυνδυασμένης απολιποπρωτεΐνης apo-E. Στη συνέχεια, μελετήσαμε την έκφραση των ANGPTLs σε HCV κλινικά δείγματα κατά τη διάρκεια της φυσικής εξέλιξης της HCV λοίμωξης και σε παρατεταμένες μολύνσεις in vitro, πριν και μετά από θεραπεία με DAAs. Tα επίπεδα της ANGPTL-3 βρέθηκαν μειωμένα σε HCV ασθενείς με προχωρημένη ηπατική ίνωση συγκριτικά με τα υπόλοιπα στάδια της ασθένειας, ενώ τα επίπεδα της ANGPTL-4 βρέθηκαν να αυξάνονται προοδευτικά, από την οξεία λοίμωξη μέχρι την ηπατική κίρρωση και τον ΗΚΚ. Τα in vitro πειράματα έδειξαν ότι μόνο τα επίπεδα της ANGPTL-3 μειώνονται τις πρώτες τέσσερις μέρες της HCV-3α μόλυνσης, ενώ και οι δύο ANGPTLs αυξάνονται αργότερα. Η θεραπεία με DAAs δεν άλλαξε τα επίπεδα της ANGPTL-3 σε ασθενείς με προχωρημένη ίνωση και κίρρωση, καθώς και στο in vitro μοντέλο ιικής κάθαρσης, το οποίο αναπτύξαμε, σε αντίθεση με τις αντίστοιχες τιμές για την ANGPTL-4. Η συσχέτιση των ANGPTLs με τον κύριο προ-ινωτικό παράγοντα TGF-β ενίσχυσε την διαφαινόμενη αντίρροπη σχέση ανάμεσα στις ANGPTLs και την ηπατική ίνωση. Συμπερασματικά, παρατηρήσαμε διαφορική έκφραση των ANGPTLs κατά την HCV μόλυνση και θεραπεία. Η ANGPTL-3 φαίνεται να αποτελεί μέρος του «μοριακού αποτυπώματος» που αφήνει ο HCV μετά την εκρίζωσή του, το οποίο θα μπορούσε να συμβάλει στην επίμονη απορρύθμιση του μεταβολισμού των λιπιδίων σε «θεραπευμένα» άτομα και να προδιαθέτει για την ανάπτυξη ΗΚΚ. Η ταυτοποίηση και διερεύνηση τέτοιων μηχανισμών βοηθά στην καλύτερη κατανόηση του κύκλου ζωής του HCV και της παθοβιολογίας της HCV-εξαρτώμενης ηπατικής νόσου και δυνητικά μπορεί να οδηγήσει σε ανάπτυξη καινοτόμων θεραπειών.