Ορχιδέες της Ελλάδας: βιολογία σπερμάτων και εκτός τόπου διατήρηση

Abstract

The aim of this PhD thesis is to study the reproductive biology of Greek orchids, with a particular focus on their seed biology. This research includes new experimental data on the germination, storage behavior, and seed morphology of Greek orchids. Additionally, it examines pollination mechanisms and the impact of pollen origin on seed quality. Programming tools are developed for storing field observations and enhancing orchid studies in Greece. The presentation of the data throughout the thesis aims to support the ex situ conservation of orchids, from anthesis to the deposition of collections in a seed bank. More specifically, the first chapter explored the accuracy displayed in flowering diagrams sourced from literature. Flowering data were collected from online sources, combined with the author’s field observations, and used to create flowering period diagrams for the orchid taxa of Greece. The data were compared with the most recent and older available literature sources, revealing clear differences with the sources, rendering the proposed methodology suitable for determining the onset of flowering and as an extension of the in situ study of the country’s Orchidaceae. Pollination in the genus Ophrys, specifically the validity of the concept of a single pollinator species per Ophrys sp., was investigated using personal observations and observations from online nature groups. A database of visits to Ophrys members by two families of beetles(Cleridae, Glaphyridae) was created. Based on the biology of the two families and their high visitation frequency, accompanied by pollen transfer, these two groups are proposed as generalized pollinators for members of the genus, while two possible interpretations of their attraction to Ophrys individuals are suggested. Thus, the description of new species based on the assumption of a single pollinator becomes unstable. The genus Ophrys is considered obligately outcrossing, yet there are observations where self-pollination occurs with or without the intervention of pollinators. The effect of pollen source (self- vs. cross-pollination) has not been explored in members of the genus. Thus, for three taxa, the impact of pollen source was studied through artificial pollination experiments. The data obtained, similar to the limited available studies in other genera of Orchidaceae, support the self-compatibility of the three taxa but indicate the low quality (viability and presence of embryo-less seeds) of seeds resulting from self-pollination compared to those from cross-pollination in the three taxa. The number of empty (embryo-less) seeds in the Orchidaceae family is a trait rarely mentioned in the literature, yet some groups exhibit significantly higher rates of empty seeds. Therefore, the relationship between the percentage of empty seeds and the pollination systemin the orchids of Greece was studied. From a total of 140 seed capsules and 74 orchid taxa in Greece, a strong statistical relationship was observed between the percentage of empty seeds and the pollination type of the taxa. It appears that taxa deceiving pollinators have significantly higher rates of empty seeds compared to those providing rewards or frequently undergoing self-pollination. Based on this observation, along with data from Chapter 3 and available literature, we propose the above trait (percentage of empty seeds) as a rapid measure and a good indicator of inbreeding depression in populations of wild orchids. Morphometric characteristics of orchid seeds have been utilized to calculate parameters such as terminal velocity, as well as to predict germination behavior and inbreeding depression(thesis data). However, significant gaps exist regarding the morphometrics of Greek orchid seeds. Chapter 5 explores the morphology of seeds in collections at the Seed Bank of the National and Kapodistrian University of Athens for 74 taxa and 140 collections. Dimensions of seeds and embryos, as well as mass for approximately one-third of the lots (49/140), are recorded. Additionally, these data are used to investigate differences in seed morphology between the two subfamilies found in Greece, with seeds of Epidendroideae appearing notablylarger in dimensions and mass .The double viability staining technique (TTZ and Trypan blue) was proposed in 2019 asa high-precision method for assessing the viability of orchid seeds and the seed destruction caused by chemical pretreatment. In Chapter 6, the application of this methodology is explored as a rapid and high-precision alternative for determining the optimal duration of chemical pretreatment in orchid germination experiments. The method appears to be reliably applicable; however, it is emphasized that there is diversity among seed lots from different years, regions, and pollination types regarding the optimal duration of pretreatment. Thus, there is a need to investigate all seed lots before germination experiments. The study of orchid germination presents significant laboratory challenges mainly due to the requirements arising from their obligatory symbiosis with fungi in their natural environment. Chapter 7 investigates the germination of 40 selected taxa from Greece. The study focuses on the effect of light on germination as well as germination in the absence of a nutrient medium, while also testing the effect of three nutrients (Mm, M1, OR) compared to germination in water (WA). The results of the study reveal the potential for a significant number(27/40) of taxa to germinate in WA, with the majority of these (18/27) showing no difference compared to germination in any of the nutrient solutions. Thus, although development up to the photosynthetic stage is not feasible without the symbiotic fungus, we propose that the germination of several species can be initiated without the symbiosis in nature, while the symbiotic relationship is established further down the development of the plant. Regarding the effect of light, the majority of taxa exhibit partial or complete photoinhibition, with only14/40 taxa germinating under alternating light conditions (12/12h L/D) and only 3/14 showing complete germination. For 3 taxa studied more thoroughly, significant heterogeneity in the effect of light quality on germination was observed, with one taxon (Anacamptis sancta)showing light indifference and two showing photoinhibition under blue light (Anacamptis papilionacea subsp. papilionacea) and under red light (Serapias vomeracea subsp. vomeracea).In Chapter 8, the germination behavior of the Orchidaceae family is studied in comparison to the morphology of their seeds using both bibliographic data and data from the Seed Bankof the University of Athens (NKUA). Specifically, the E:S ratio (embryo length/seed length)is used, and a statistical relationship is observed between germination behavior and this ratio. Based on characteristics of the biology of the species under study (203 from around theworld), their phylogenetic position, and their distributional ranges, a hypothesis is formed regarding the evolution of their seeds based on the movements of groups from open to shadedhabitats, along with a shift in their position on the spectrum of mycoheterotrophy (from autotrophic to fully mycoheterotrophic). Initially, it was believed that most orchid seeds could not be stored for long periods in seedbanks (-20 οC, 15% r.h.). However, studies on their storage behavior revealed significant gaps, particularly regarding initial viability values. More recently, a significant number of taxa have been documented to exhibit orthodox seeds, suggesting the potential for longer-term storage. In Chapter 9, the storage behavior of orchid seeds from Greece is studied using the double staining viability method, taking into account the variability that may occur in initial viability. Based on the results from the collections that were tested, significant variability in initial viability values (immediately after seed collection) is observed. At the same time, it appears that the majority of older collections (>70%) largely maintain their viability, with no significant changes compared to germination values at the time of their collection. However, significantly lower viability is observed in collections stored in the Seed Bank (-20°C) compared to those stored in the refrigerator (5 oC) and in the laboratory. These data suggest storing orchid seeds at temperatures above 0°C, while it is also noted from the literature and the author’s observations that seed dehydration should be carried out in the absence of a drying agent, as several species show decreased viability after extensive dehydration. In Chapter 10, the development of a tripartite application (comprising a trait database, field observation records database, and a species identification tool) for Greek orchids is outlined. The mentioned application, OrchidNETGR, has the potential to serve as a foundation for engaging citizens and researchers in the study and conservation of Greek orchids, providing a platform for information and participation. Finally, based on the information gathered in this work, methodologies for ex situ conservation of orchids in seed banks are proposed. Specifically, elements of orchid biology are used to suggest the boundaries of the collection area and the number of samples, for distinct functional groups. Also, recommendations are made regarding the type of samples, the methodology for identifying the appropriate collection period, as well as the storage of samples after their return to the laboratory.

Ο στόχος της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής είναι η μελέτη της αναπαραγωγικής βιολογίας των ορχιδεών της Ελλάδας, με έμφαση στην βιολογία των σπερμάτων τους. Συλλέγονται νέα πειραματικά δεδομένα για την φύτρωση, την αποθηκευτική συμπεριφορά και την μορφολογία των σπερμάτων της οικογένειας Orchidaceae της χώρας. Παράλληλα συγκεντρώνονται παρατηρήσεις σχετικά με την επικονίαση καθώς και την επίδραση της προέλευσης της γύρης στην ποιότητα των σχηματιζόμενων σπερμάτων. Επίσης, διαμορφώνονται εργαλεία πληροφορικής για την βελτιστοποίηση των παρατηρήσεων πεδίου αλλά και γενικότερα της μελέτης των ορχιδεών της Ελλάδας. Η παρουσίαση των δεδομένων της διατριβής, σε όλη την έκταση του κειμένου, γίνεται με άξονα την εκτός τόπου διατήρησητης οικογένειας Orchidaceae στην Ελλάδα και εκτείνεται από το στάδιο της ανθοφορίας έως το στάδιο της αποθήκευσης των συλλογών στην Τράπεζα Σπερμάτων. Συγκεκριμένα, στο Κεφάλαιο 1, διερευνώνται τα χρονικά διαγράμματα ανθοφορίας καιη ακρίβεια των σχετικών βιβλιογραφικών πηγών. Πραγματοποιήθηκε συλλογή στοιχείων ανθοφορίας από πηγές του διαδικτύου σε συνδυασμό με τις παρατηρήσεις πεδίου του συγγραφέα και διαμορφώθηκαν διαγράμματα περιόδου ανθοφορίας για τα taxa των ορχιδεών της Ελλάδας. Τα δεδομένα συγκρίθηκαν αφενός με την πιο πρόσφατη και αφετέρου με την παλαιότερη διαθέσιμη βιβλιογραφική πηγή και εντοπίστηκαν σαφείς διαφορές μεταξύ τους, καθιστώντας την προτεινόμενη μεθοδολογία κατάλληλη για τον προσδιορισμό της περιόδου έναρξης ανθοφορίας και ως επέκταση της in situ μελέτης των Orchidaceae της χώρας. Η επικονίαση στο γένος Ophrys και συγκεκριμένα η ορθότητα της ιδέας του μοναδικούεπικονιαστή ανά είδος Ophrys sp. διερευνάται στο Κεφάλαιο 2. Με την χρήση προσωπικώνπαρατηρήσεων αλλά και αναφορών από φυσιολατρικές ομάδες διαμορφώθηκε μια βάση δεδομένων επισκέψεων, σε μέλη του γένους Ophrys, από δύο οικογένειες κολεοπτέρων (Cleridae, Glaphyridae) με βάση την βιολογία των δύο οικογενειών και της υψηλής συχνότητας επίσκεψης, που συνοδεύεται από μεταφορά πολλιναρίων, προτείνονται οι δύο ομάδες ως γενικευμένοι επικονιαστές ενώ παράλληλα προτείνονται δύο πιθανές ερμηνείες της προσέλκυσής τους σε άτομα του γένους Ophrys. Έτσι, θεωρούμε ότι η περιγραφή νέων ειδών με βάση την υπόθεση του μοναδικού επικονιαστή καθίσταται ασταθής. Το γένος Ophrys θεωρείται ένα υποχρεωτικά ετεροεπικονιαζόμενο γένος ορχιδεών, ωστόσο υπάρχουν παρατηρήσεις όπου η αυτοεπικονίαση συμβαίνει με ή χωρίς την μεσολάβηση επικονιαστών. Η επίδραση της προέλευσης της γύρης (αυτο- και ετερο-επικονίαση) δεν έχει διερευνηθεί στα μέλη του γένους. Έτσι, για τρία taxa μελετάται (Κεφάλαιο 3) η επίδραση της προέλευσης της γύρης με πειράματα τεχνητής επικονίασης και τα δεδομένα που προέκυψαν, παρόμοια προς τις περιορισμένες διαθέσιμες εργασίες σε άλλα γένη των Orchidaceae, υποστηρίζουν μεν την αυτοσυμβατότητα των τριών taxa αλλά καταδεικνύουν την χαμηλή ποιότητα (περιορισμένη βιωσιμότητα και συχνή απουσία εμβρύου) των σπερμάτων που προκύπτουν από την αυτοεπικονίαση σε σχέση με εκείνα που παράγονται με ετεροεπικονίαση (στα συγκεκριμένα τρία taxa). Ο αριθμός των κενών (χωρίς έμβρυο) σπερμάτων στην οικογένεια Orchidaceae αποτελεί έναν χαρακτήρα που αναφέρεται πολύ σπάνια στην βιβλιογραφία, ωστόσο φαίνεται πως κάποιες ομάδες παρουσιάζουν συγκριτικά υψηλά ποσοστά κενών σπερμάτων. Έτσι, στο Κεφάλαιο 4 διερευνάται η σχέση του ποσοστού των παραγόμενων κενών σπερμάτων και του συστήματος επικονίασης στις ορχιδέες της Ελλάδας. Από ένα σύνολο 140 σπορομερίδων και 74 taxa των ορχιδεών της Ελλάδας, διαπιστώνουμε μια στατιστική σχέση μεταξύ του ποσοστού κενών σπερμάτων και του τύπου επικονίασης των taxa. Έτσι φαίνεται, πως τα taxa που εξαπατούν τους επικονιαστές έχουν σημαντικά υψηλότερα ποσοστά κενών σπερμάτων σε σχέση με αυτά που παρέχουν ανταμοιβή ή/και παρουσιάζουν συχνή αυτοεπικονίαση. Με βάση την παραπάνω παρατήρηση καθώς και τα δεδομένα του Κεφαλαίου 3 και της διαθέσιμης βιβλιογραφίας προτείνουμε τον χαρακτήρα «ποσοστό κενών σπερμάτων» ως μια έμμεση (proxy) παράμετρο που αποτελεί ταχεία μέθοδο μέτρησης αλλά και ικανοποιητική ένδειξη του ομομικτικού υποβιβασμού σε πληθυσμούς άγριων ορχιδεών. Μορφομετρικοί χαρακτήρες των σπερμάτων των ορχιδεών έχουν χρησιμοποιηθεί στο παρελθόν για τον υπολογισμό στοιχείων όπως η τελική ταχύτητα πτώσης (terminal velocity), αλλά και της πρόβλεψης της φυτρωτικής συμπεριφοράς και του ομομικτικού υποβιβασμού (δεδομένα διατριβής), ωστόσο για τις ορχιδέες της Ελλάδας υπάρχουν σημαντικά κενά όσον αφορά την μορφομετρία των σπερμάτων τους. Στο Κεφάλαιο 5 γίνεται διερεύνησητης μορφολογίας των σπερμάτων των συλλογών της Τράπεζας Σπερμάτων του Ε.Κ.Π.Α. Για74 taxa και 140 συλλογές καταγράφονται οι διαστάσεις των σπερμάτων και των εμβρύων καθώς και η μάζα για περίπου το 1/3 αυτών (49/140). Παράλληλα, τα στοιχεία αυτά χρησιμοποιούνται για την διερεύνηση διαφορών της μορφολογίας των σπερμάτων μεταξύ των δύο υποοικογενειών που απαντούν στην Ελλάδα, με τα σπέρματα των Epidendroideae να εμφανίζονται σαφώς μεγαλύτερα σε διαστάσεις και μάζα έναντι των Orchidoideae. Η διπλή χρώση βιωσιμότητας (TTZ και Trypan Blue) προτάθηκε το 2019 ως μια μέθοδος υψηλής ακρίβειας για τον υπολογισμό τόσο της βιωσιμότητας των σπερμάτων ορχιδεών όσο και της επίπτωσης (νέκρωσης) που προκαλείται από την χημική προκατεργασία στην οποία υποβάλλονται κατά κανόνα τα σπέρματα των ορχιδεών προκειμένου να απολυμανθούν επιφανειακά και να ελαχιστοποιηθούν οι πιθανότητες ανάπτυξης μικροοργανισμών στο θρεπτικό υπόστρωμα φύτρωσης. Στο Κεφάλαιο 6 διερευνάται η εφαρμογή της νέας αυτής μεθοδολογίας ως ταχείας και υψηλής ακρίβειας εναλλακτικής λύσης για τον υπολογισμό της βέλτιστης διάρκειας χημικής προκατεργασίας στα πειράματα φύτρωσης ορχιδεών. Η μέθοδος φαίνεται πως μπορεί να χρησιμοποιηθεί αξιόπιστα, ωστόσο τονίζεται η ποικιλομορφία μεταξύ των σπορομερίδων από διαφορετικά έτη, περιοχές και τύπους επικονίασης όσον αφορά την βέλτιστη διάρκεια προκατεργασίας και επομένως απαιτείται ο έλεγχος όλων των σπορομερίδων πριν από τα πειράματα φύτρωσης. Η μελέτη της ασυμβιωτικής φύτρωσης στις ορχιδέες παρουσιάζει σημαντικές εργαστηριακές δυσκολίες, κυρίως εξαιτίας των θρεπτικών απαιτήσεών τους, που στο φυσικό τους περιβάλλον ικανοποιούνται από την υποχρεωτική συμβίωση με μύκητες. Στο Κεφάλαιο 7 μελετάται η φύτρωση υπό ασυμβιωτικές συνθήκες σε 40 επιλεγμένα taxa τηςΕλλάδας. Η μελέτη επικεντρώνεται στην επίδραση του φωτός στην φύτρωση καθώς και στην φύτρωση απουσία θρεπτικού μέσου, ενώ επίσης δοκιμάζεται και η επίδραση τριών θρεπτικών μέσων (Mm, M1, OR) σε σύγκριση με την φύτρωση στο νερό (WA). Τα αποτελέσματα της μελέτης φανερώνουν την δυνατότητα σημαντικού αριθμού (27/40) taxa να φυτρώνουν σε WA ενώ για την πλειοψηφία αυτών (18/27) δεν εμφανίζεται διαφορά με την φύτρωση σε κάποιο από τα θρεπτικά. Έτσι, αν και η ανάπτυξη μέχρι το φωτοσυνθετικό στάδιο δεν είναι φυσικά εφικτή απουσία του συμβιώτη μύκητα, συνάγεται ότι στην φύση και για αρκετά είδη είναι πιθανή η έναρξη της φύτρωσης χωρίς συμβιωτικές σχέσεις, οι οποίες μπορεί να εγκαθίστανται σε επόμενο στάδιο του κύκλου ζωής του φυτού. Σχετικά με την επίδραση του φωτός, η πλειονότητα των taxa παρουσιάζουν μερική ή πλήρη φωτοαναστολή (δηλαδή φύτρωση σε συνθήκες συνεχούς σκότους) και μόνο 14/40 taxa παρουσιάζουν ικανότητα φύτρωσης και σε συνθήκες εναλλασσόμενων συνθηκών φωτός-σκότους και από αυτά τα3/14 εμφανίζουν πλήρη φύτρωση. Για 3 taxa που μελετήθηκε διεξοδικότερα η επίδραση της ποιότητας του φωτός στην φύτρωση, παρατηρήθηκε σημαντική ετερογένεια, με ένα taxon (Anacamptis sancta) να παρουσιάζει φωτοαδιαφορία και δύο να εμφανίζουν αναστολή κάτω από κυανό ή ανοικτό ερυθρό φως (Anacamptis papilionacea subsp. papilionacea και Serapiasvomeracea subsp. vomeracea, αντίστοιχα). Στο Κεφάλαιο 8 μελετάται η φυτρωτική συμπεριφορά της οικογένειας Orchidaceae σε σύγκριση με την μορφολογία των σπερμάτων, με χρήση τόσο των πειραματικών δεδομένων και παρατηρήσεων της Τράπεζας Σπερμάτων του Ε.Κ.Π.Α. όσο και δεδομένων από την διεθνή βιβλιογραφία. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιείται ο μορφομετρικός λόγος E:S (μήκος εμβρύου/μήκος σπέρματος) και διαπιστώνεται ισχυρή στατιστική σχέση μεταξύ της φυτρωτικής συμπεριφοράς και του λόγου E:S. Με βάση τα διάφορα χαρακτηριστικά της βιολογίας των υπό μελέτη ειδών (203 από όλο τον κόσμο), την φυλογενετική τους θέση και την οικολογία της εξάπλωσής τους, διατυπώνεται μία νέα υπόθεση για την εξέλιξη των σπερμάτων της οικογένειας στη βάση των ‘μετακινήσεων’ ορισμένων ομάδων από ανοικτά σε σκιασμένα ενδιαιτήματα παράλληλα με την ‘μετακίνηση’ στο φάσμα της μυκοετεροτροφίας (από αυτότροφα taxa σε πλήρως μυκοετερότροφα). Για τα σπέρματα των ορχιδεών υπάρχει η γενική πεποίθηση πως δεν είναι δυνατόν να αποθηκεύονται για μεγάλα χρονικά διαστήματα σε τράπεζες σπερμάτων (-20 °C, 15%R.H.), ωστόσο η διεθνής βιβλιογραφία της αποθηκευτικής συμπεριφοράς παρουσιάζει σημαντικά κενά κυρίως ως προς τις αρχικές τιμές βιωσιμότητας. Πρόσφατα έχει αρχίσει να καταγράφεται σημαντικός αριθμός taxa που παρουσιάζουν πραγματικά ορθόδοξα σπέρματα και προς την κατεύθυνση της αποσαφήνισης της αποθηκευτικής τους συμπεριφοράς, στο Κεφάλαιο 9 μελετώνται οι ορχιδέες της Ελλάδας χρησιμοποιώντας την μέθοδο της διπλής χρώσης βιωσιμότητας και λαμβάνοντας υπόψη την ποικιλομορφία που μπορεί να εμφανίζεται στην αρχική βιωσιμότητα. Με βάση τα αποτελέσματα από τις συλλογές που ελέγχθηκαν, παρατηρείται σημαντική ποικιλότητα στις αρχικές τιμές βιωσιμότητας (αμέσως μετά την συλλογή των σπερμάτων). Παράλληλα, φαίνεται ότι η πλειονότητα των παλαιότερων συλλογών (>70%) διατηρούν σε σημαντικό βαθμό την βιωσιμότητά τους, χωρίς σημαντικές μεταβολές σε σύγκριση με τις τιμές φυτρωτικότητας κατά το έτος συλλογής τους. Επίσης παρατηρείται σημαντικά χαμηλότερη βιωσιμότητα στις συλλογές που βρίσκονταν αποθηκευμένες στην Τράπεζα Σπερμάτων (-20 °C) σε σχέση με αυτές που είχαν αποθηκευτεί στο ψυγείο (5 °C) και στο εργαστήριο. Τα παραπάνω δεδομένα υποδεικνύουν την αποθήκευση των σπερμάτων ορχιδεών σε θερμοκρασίες άνω του 0 °C ενώ παράλληλα φαίνεται από την βιβλιογραφία αλλά και παρατηρήσεις του συγγραφέα πως η αφυδάτωση των σπερμάτων πρέπει να πραγματοποιείται απουσία μέσου αφυδάτωσης καθώς αρκετά είδη εκδηλώνουν απώλεια βιωσιμότητας από την έντονη αφυδάτωση. Στο Κεφάλαιο 10 περιγράφεται η διαμόρφωση μιας τριμερούς ψηφιακής εφαρμογής (βάση δεδομένων, βάση παρατηρήσεων πεδίου, εφαρμογή αναγνώρισης ειδών) για τις ορχιδέες της Ελλάδας (OrchidNETGR). Αυτή η εφαρμογή μπορεί να αποτελέσει βάση για την ενημέρωση και την ενεργό συμμετοχή των πολιτών (αλλά και των ερευνητών) στην μελέτη και προστασία των ορχιδεών της Ελλάδας. Τέλος, με βάση τις πληροφορίες που συγκεντρώθηκαν στην παρούσα διατριβή προτείνονται μεθοδολογίες εκτός τόπου διατήρησης των ορχιδεών σε τράπεζες σπερμάτων (Κεφάλαιο 11). Πιο συγκεκριμένα χρησιμοποιούνται στοιχεία της βιολογίας των ορχιδεών για να καθορισθούντα όρια της περιοχής συλλογής και ο αριθμός δειγμάτων, για διακριτές λειτουργικές ομάδες. Ταυτόχρονα προτείνεται ο τύπος δειγμάτων, η μεθοδολογία αναγνώρισης της κατάλληλης περιόδου συλλογής των καψών/σπερμάτων καθώς και οι συνθήκες αποθήκευσής τους μετά την επιστροφή στο εργαστήριο.