Étude du transcriptome du champignon phytopathogène Botrytis cinerea lors de l’interaction avec Arabidopsis thaliana

Abstract

Botrytis cinerea, causing the grey mould disease, is a necrotrophic and broad-spectrum pathogen of the Leotiomycete class. The PhD thesis presents a transcriptomic study on macroarrays contaning approximately one fifth of the fungus’ genome, as well as the functional characterization of two proteins identified by this analysis. The transcriptomic study concerned three stages of the in planta interaction of B. cinerea with the plant model Arabidopsis thaliana. Analysis of the corresponding data allowed identifying 27 genes specifically expressed during one or more stages of the infection. Genetic inactivation of two of these genes, BcPIE3 and BcPIC5, altered the pathogenicity of the wild-type strain T4 up to at least 69%, confirmingthe initial hypothesis that genes induced in planta are involved in the infectious process. The inactivation of the same genes in the BO5.10 genetic context did not affect this strains’ pathogenicity, indicating that BcPIE3 and BcPIC5 genes code for strain-dependent virulence factors. This result reflects the polymorphism of the B. cinerea species. Both inactivated genes belong to multigenic families. BcPIC5, whose expression reaches its maximum level at the complete colonization stage, codes for the unique peptidyl-prolyl FKBP12 isomerase of B. cinerea. The BcPIC5 protein was shown to mediate the toxic effects of two inhibitors, FK506 and rapamycin. In eukaryotes, the FKBP12/FK505 and FKBP12/rapamycin complexes inhibit the phosphatase calcineurin and the kinase TOR, respectively. This offers the possibility to identify the gene targets of these two regulators in the future. BcPIE3, whose expression is induced since the appressoria formation stage and reaches its maximum level 24 hours post-penetration, codes for an emopamil-binding domain (EBD) protein. BcPIE3 is, in contrast to its human ortholog, dispensable for ergosterol biosynthesis. This gene may have acquired a new function related to the interactions of the pathogen with plants. BcPIE3 protein is member of an eukaryotic structural superfamily (EBDPs), whose fungal members were identified here for the first time. Based on a phylogenetic analysis of the EBDP superfamily, BcPIE3 belongs to the monophyletic clade of EBPs, which shows a specific expansion within the Euascomycete phylum. Moreover, B. cinerea is the only species coding for three instead of two EBPs in its genome. The unique EBP gene of B. cinerea is up-regulated during the infection and is present in other Botrytis species. Overall, results of the present thesis, where a large-scale in planta transcriptomic analysis was conducted for the first time, highlighted new aspects of the infectious process.

Ο Ασκομύκητας Botrytis cinerea είναι ένα πολυφάγο και νεκρότροφο παθογόνο των φυτών. Προκαλεί ασθένειες σε ένα ευρύ φάσμα φυτών, που συνεπάγονται σημαντικές οικονομικές απώλειες, ενώ η καταπολέμησή του περιορίζεται στη χρήση μυκητοκτόνων, καθώς δεν υπάρχουν ανθεκτικές ποικιλίες στα καλλιεργούμενα είδη φυτών που προσβάλλει. Η μοριακή βάση της παθογένειας του είδους ήταν σχεδόν άγνωστη όταν διεξήχθη η διδακτορική μου μελέτη, λόγω μη διαθεσιμότητας του γονιδιώματος. Σε αυτό το πλαίσιο, η διδακτορική μου διατριβή με τίτλο «Ανάλυση του μεταγραφώματος του φυτοπαθογόνου μύκητα Botrytis cinerea κατά την αλληλεπίδραση με Arabidopsis thaliana» εστίασε στην ταυτοποίηση των γενετικών τόπων που ελέγχουν την παθογένεια μέσω μεταγραφωμικής ανάλυσης. Για αυτό το σκοπό αξιοποιήθηκαν τμήματα του μεταγραφώματος (expressed sequence tags/EST) τα οποία είχαν αλληλουχηθεί και εντυπωθεί σε μακροσυστοιχίες (1ο άρθρο στο Παράρτημα), ενώ παράλληλα έγιναν προσπάθειες για κατασκευή υβριδικών βιβλιοθηκών από την συνθήκη μόλυνσης (αδημοσίευτα δεδομένα) και για συντονισμό σε διεθνές επίπεδο για αλληλούχιση του γονιδιώματος (2o άρθρο στο Παράρτημα). Στο κυρίως μέρος του διδακτορικού, το οποίο οδηγησε σε 2 άρθρα στα οποία είμαι πρώτος συγγραφέας και συγραφέας αναφοράς, διεξήχθηκαν πειράματα μόλυνσης του φυτού Arabidopsis thaliana σε χρονοσειρά για την εξαγωγή RNA που υβριδοποιήθηκε στις μακροσυστοιχίες, και οι στατιστικές και βιοπληροφορικές αναλύσεις που ακολούθησαν εντόπισαν μια λίστα γονιδίων που παρουσιάζουν διαφορική έκφραση in planta. Δύο γονίδια που προέκυψαν από αυτή την ανάλυση χαρακτηρίστηκαν με μεθόδους κλασσικής γενετικής (απενεργοποίηση και κατόπιν επαναφορά γονιδίων), τεστ παθογενειας in planta, βιοχημικά τεστ, περαιτέρω αναλύσεις έκφρασης και γονιδιακά δέντρα. Στη διατριβή παρουσιάζονται επίσης και αδημοσίευτα αποτελέσματα που αφορούν περαιτέρω λειτουργικό χαρακτηρισμό ενός γονιδίου που μελετήθηκε με μεθόδους μαζικής απομόνωσης μεταβολιτών (metabolomics). Το διδακτορικό μου συμπεριέλαβε ακόμα συγκέντρωση βιβλιογραφικών δεδομένων και αναλύσεις δομής και σχολιασμό (annotation) για μια σειρά γονιδίων που ταυτοποίησα μέσω στατιστικής ανάλυσης του μεταγραφώματος ως επαγόμενα in planta. Ο σκοπός ήταν να καταλήξω σε ένα περιορισμένο αριθμό γονιδίων τα οποία το εργαστήριο θα μελετούσε και μετά το διδακτορικό μου, όπως και έγινε στα επόμενα χρόνια. Η διατριβή περιλαμβάνει επίσης μια γενική εισαγωγή στο μοντέλο της μελέτης B. cinerea, Μεθόδους και Υπόμνημα με πρωτογενή δεδομένα οντολογιών και αλληλουχιών.

Botrytis cinerea, l’agent responsable de la pourriture grise, est un nécrotrophe généraliste de la classe des Leotiomycètes. Nous présentons ici une analyse du transcriptome de B. cinerea par macroarrays, contenant environ un cinquième de ses gènes, ainsi que l’analyse fonctionnelle de deux protéines identifiées grâce à cette analyse. L’analyse transcriptomique s’est portée sur trois stades de l’interaction du pathogène avec la plante-modèle Arabidopsis thaliana. Cette analyse a permis de sélectionner 27 gènes spécifiquement exprimés à un ou plusieurs stades de l’infection. L’inactivation de deux d’entre eux, BcPIE3 et BcPIC5, a altéré le pouvoir pathogène de la souche sauvage T4 d’au moins 69 %, confirmant notre hypothèse que les gènes induits in planta sont impliqués dans le processus infectieux. L’inactivation des mêmes gènes n’ayant pas affecté la pathogénie de la souche sauvage B05.10, ces gènes représentent des facteurs de pathogénie souche dépendants. Ce résultat reflète bien le polymorphisme de l’espèce. Les deux gènes inactivés appartiennent à des familles multigéniques. Le gène BcPIC5, dont l’expression est graduellement induite au long de l’infection et atteint son maximum au stade de colonisation complète, code pour l’unique FKBP12 peptidyl-prolyl isomerase de B. cinerea. La protéine BcPIC5 est le médiateur des effets cytotoxiques de deux inhibiteurs, FK506 et rapamycine. Chez les eucaryotes, les complexes FKBP12/FK506 et FKBP12/rapamycine inhibent la phosphatase calcineurine et la kinase TOR respectivement, ce qui nous offre la possibilité d’étudier les gènes-cibles de ces deux régulateurs dans le futur. Le gène BcPIE3, dont l’expression est induite depuis le stade de formation de l’appressorium et atteint son maximum 24 heures après pénétration, code pour une « emopamil-binding domain » (EBD) protéine. BcPIE3 est, contrairement à son orthologue humain, non indispensable à la biosynthèse de l’ergosterol. Ce gène pourrait avoir acquis une nouvelle fonction liée aux interactions avec la plante. Nous avons montré que la protéine BcPIE3 appartient à une superfamille structurelle eukaryotique (protéines EBDP), dont les membres fongiques ont été identifiés pour la première fois ici. Selon une analyse phylogénétique de la superfamille, la protéine BcPIE3 appartient au clade monophylétique des EBP, qui montre une expansion spécifique à la lignée des Euascomycètes. De plus, B. cinerea est la seule espèce possédant trois EBP dans son génome. Le troisième gène EBP est présent dans d’autres espèces du genre Botrytis est il est induit in planta. Cette première analyse transcriptomique à grande échelle a mis en évidence de nouveaux aspects du processus infectieux.