Νέα δεδομένα στη συγκρότηση και έκφραση των υποδοχέων των Τ λεμφοκυττάρων σε όχι-Τ κύτταρα

Abstract

Conventionally T cell receptors (TCR) have so far been considered as a T-lymphocyte privilege, but recent findings also place TCR expression in non-T cells. In order to examine the ectopic expression of TCR, this study focused on myeloid cells (RAW 264.7, WEHI-3B, HL-60, spleen macrophages and MDSCs), spleen B lymphocytes and spermatozoa. Immunofluorescence experiments detected TCRαβ and γδ molecules on the surface of all these cell types, with the exception of MDSCs and B lymphocytes. In the case of macrophage-like RAW 264.7 cells and spermatozoa TCR expression was also verified by RT-PCR experiments which, except from the predicted gene products, detected additional products for the α- and γ-chain. The promyeloblast HL-60 cells were distinguished from the macrophage-like cells of the study because TCR molecules were not only present on their surface, but also intracellularly, showing rapid trafficking from/towards the membrane. Furthermore, the selection and culture of the TCRγδ+ HL-60 clone revealed that the expression of TCRγδ on these cells was transient. Extended research of the ectopic TCR expression from a functional point of view was conducted on RAW 264.7 cells. The expression of TCRαβ and γδ (71 και 41%, respectively) on the surface of RAW 264.7 cells, was accompanied by CD4 and CD8 molecules (61 και 14%, respectively), but not by the expected expression of the coreceptors CD3ε and CD3ζ which was 9 and 7%, respectively. Such observations contradicted the existing knowledge, and indicated that TCR would be supported by other molecules for reaching the membrane and transducing their signal. Such candidate molecules could be the Fcγ receptors (FcγR). Indeed, the FcγRII/III receptor was found to be expressed in 75% of the cells, which also expressed at a percentage of 25% MHCII molecules. Engagement of the FcγRII/III receptor by a recombinant IgG2aCH2 fragment, except from stimulating the macrophage-dependent properties of the cells, was shown to reduce expression of TCRαβ and γδ indicating that FcγRII/III was indeed used by TCRs for their transport to the cell membrane. In order to examine the ability of RAW 264.7 cells to simultaneously display antigen presenting- and T-cell properties, functional experiments as to antigen-specific antibody and IL-2 production were performed. In in vitro immunization assays in the presence of naïve B cells, RAW264.7 failed to promote antibody production. However, RAW 264.7 cells could compete with antigen-stimulated macrophages but not T cells when applied to a system of in vivo antigen-sensitized cells followed by an in vitro immunization protocol. Interestingly, simultaneous addition of antigen and the IgG2aCH2 fragment to RAW 264.7 cells could promote IL-2 production from the cells, indicating that FcγRII/III activation could also support TCR stimulation. All the above findings, dictate novel regulatory mechanisms of the immune system through TCR expression in non-T cells.

Η επικρατούσα άποψη ότι ο TCR (T cell receptor) αποτελεί αποκλειστικό προνόμιο των Τ λεμφοκυττάρων έχει αρχίσει να ανατρέπεται, καθώς έρευνες πλέον δείχνουν ότι ο υποδοχέας μπορεί επίσης να εκφράζεται σε κύτταρα που δεν ανήκουν στην Τ-λεμφική σειρά. Με στόχο να εξεταστεί η έκτοπη έκφραση του TCR, η παρούσα μελέτη επικεντρώθηκε σε κύτταρα μυελικής προέλευσης (RAW 264.7, WEHI-3B, HL-60, μακροφάγα και MDSCs σπλήνα), σε Β λεμφοκύτταρα σπλήνα και σε σπερματοζωάρια. Πειράματα ανοσοφθορισμού ανίχνευσαν μόρια TCRαβ και γδ στην επιφάνεια των κυττάρων αυτών, εκτός των MDSCs και των B λεμφοκυττάρων. Στην περίπτωση των μακροφαγικών RAW 264.7 κυττάρων και των σπερματοζωαρίων, η TCR έκφραση επιβεβαιώθηκε επίσης από διαδικασίες RT-PCR οι οποίες μάλιστα εντόπισαν, πέρα από τα αναμενόμενα γονιδιακά προϊόντα, επιπρόσθετα προϊόντα στην α και γ αλυσίδα. Τα προμυελοβλαστικά HL-60 κύτταρα ξεχώρισαν από τα μακροφαγικά κύτταρα της μελέτης διότι παρουσίασαν όχι μόνο επιφανειακή, αλλά και ενδοκυττάρια έκφραση TCR, με μία ταχύρρυθμη κυκλοφορία του υποδοχέα από/προς την μεμβράνη. Επιπλέον, η απομόνωση και καλλιέργεια του TCRγδ+ HL-60 κλώνου φανέρωσε ότι η έκφραση του TCRγδ στα κύτταρα αυτά είναι παροδική. Μία εις βάθος έρευνα της έκτοπης TCR έκφρασης σε λειτουργικό επίπεδο πραγματοποιήθηκε στα RAW 264.7 κύτταρα. Η έκφραση του TCRαβ και γδ (71 και 41%, αντίστοιχα) στην μεμβράνη των RAW 264.7, συνοδεύονταν από τα συνδιεγερτικά μόρια CD4 και CD8 (61 και 14%, αντίστοιχα) αλλά όχι από την αναμενόμενη έκφραση των συνυποδοχέων CD3ε και CD3ζ η οποία ήταν 9 και 7%, αντίστοιχα. Τα χαμηλά επίπεδα CD3 συγκριτικά με τα υψηλά επίπεδα TCR, έρχονται σε αντίθεση με την συμβατική γνώση για την συγκρότηση του TCR. Έτσι, προτάθηκε ο Fcγ υποδοχέας (FcγR) ως υποψήφιο μόριο που θα μπορούσε να αντικαταστήσει το CD3. Πράγματι, ο FcγRΙΙ/ΙΙΙ βρέθηκε να εκφράζεται στο 75% των RAW 264.7 κυττάρων, τα οποία εξέφραζαν και 25% MHCII. Η δέσμευση του FcγRΙΙ/ΙΙΙ από ένα ανασυνδυασμένο IgG2aCH2 τμήμα, εκτός του ότι διέγειρε τις μακροφαγο-ειδικές ιδιότητες των RAW 264.7, προκάλεσε μείωση των TCRαβ και γδ μορίων υποδεικνύοντας ότι ο FcγRII/III χρησιμοποιείται από τον TCR για την μεταφορά του στην κυτταρική μεμβράνη. Η ικανότητα των RAW 264.7 κυττάρων να δρουν ταυτόχρονα ως αντιγονοπαρουσιαστικά και ως Τ κύτταρα, ελέγχθηκε με λειτουργικές δοκιμασίες ως προς την παραγωγή αντιγονο-ειδικού αντισώματος και IL-2. Σε δοκιμές in vitro ανοσοποίησης παρουσία παρθένων Β λεμφοκυττάρων, τα RAW 264.7 κύτταρα δεν οδήγησαν σε παραγωγή αντισώματος. Ωστόσο, αποδείχθηκε ότι, όταν εφαρμοστούν σε ένα σύστημα από in vivo εκτεθειμένα σε αντιγόνο κύτταρα που ακολουθείται από in vitro ανοσοποίηση, τα RAW 264.7 κύτταρα μπορούν να ανταγωνίζονται τα μακροφάγα αλλά όχι τα Τ λεμφοκύτταρα. Είναι ενδιαφέρον όμως, ότι η ταυτόχρονη προσθήκη αντιγόνου και IgG2aCH2 τμήματος στα RAW 264.7 οδήγησε σε παραγωγή IL-2 από τα κύτταρα, υποδεικνύοντας ότι η ενεργοποίηση του FcγRΙΙ/ΙΙΙ μπορεί επίσης να υποστηρίζει την διέγερση του TCR. Επομένως, όλα τα παραπάνω φανερώνουν νέους ρυθμιστικούς μηχανισμούς του ανοσοποιητικού συστήματος μέσω έκφρασης του TCR από τα μη-λεμφικής προέλευσης κύτταρα.