Computational studies of protein aggregation for the diagnosis and treatment of amyloidoses

Abstract

Under denaturing conditions, many proteins fail to acquire or maintain their native structure, leading to the adoption of an alternative – non-native – fold. While the cell has mechanisms to preserve protein homeostasis, these can fail resulting in misfolded proteins accumulating in the cell. The misfolded proteins can then assemble into either amorphous aggregates or organized aggregates, the latter called amyloid fibrils. A wide range of diseases are caused by the deposition of amyloid fibrils, these are called amyloidoses and are a subset of conformational diseases. Examples of amyloidoses include neurodegenerative diseases, such as Alzheimer’s disease and Parkinson’s disease, type 2 diabetes, and transthyretin amyloidosis. At least 38 proteins and protein products have been shown to assemble into pathological amyloids in human, in either their wild-type or mutated variants. The amyloid deposits formed by these amyloidogenic proteins may contain other proteins; the role of these co-deposited proteins in disease is under investigation. Protein aggregation can be instigated by an array of factors, such as stress or mutation, that cause some proteins to become misfolded and accumulate. The amyloidogenic proteins, or proteins with the propensity to form amyloids, represent a unique protein dataset that differs in regard to both their native sequence and their native structure, but whose amyloid fibrils share fundamental morphological and structural characteristics. Experimental studies have demonstrated that within these proteins exist small peptide sequences that are characterized as aggregation-prone regions and referred to as “amyloidogenic determinants”. In the native state, most aggregation-prone regions remain hidden within the protein but when misfolded they become exposed and aggregates are formed. Since these regions actively participate during amyloid fibril assembly they are, by extension, linked to the development of amyloidoses. Many amyloidoses, including the vigorously studied Alzheimer’s disease, lack well-defined diagnostic criteria and have few or no effective treatments. Given the difficulty and limitations of human studies, researchers will often rely on model organisms and in vitro experiments to study these diseases. Computational tools and studies provide invaluable guidance for such experiments by narrowing down a vast array of targets. Databases can provide easy access to an ever-increasing amount of data, such as genetic polymorphisms or molecular interactions. Predictive algorithms can be used to determine aggregation-prone regions found in the sequence of amyloidogenic proteins. Biological networks can provide the system-wide perspective necessary for the study of complex disease mechanisms, which would otherwise be unattainable without computational methods. A wealth of knowledge has been accumulated about aggregation and amyloidogenicity, and yet, many questions remain unanswered. Therefore, the aim of this doctoral thesis, which took place at the Department of Cell Biology & Biophysics under the supervision of Associate Professor Vassiliki A. Iconomidou, was to conduct computational studies that will help answer some of the many remaining questions regarding protein aggregation and amyloidogenicity. The systemic exploration of amyloidogenic proteins or proteins related to protein aggregation was achieved with the use of computational methodologies. For example, the analysis of biological networks—such as protein-protein interaction networks—was used to explore the relationships underlying amyloidogenicity, to compare disease-related molecular mechanisms in humans and model organisms, and to identify promising drugs and drug targets. The ultimate aim of this dissertation was the computational study of amyloidogenic proteins and their aggregation mechanism in order to contribute, along with experimental approaches, to the diagnosis and treatment of amyloidoses. The results of this dissertation are split into five projects, each corresponding to a published, submitted or ready for submission scientific research article. Amyloidogenic proteins and polymorphisms Protein aggregation and amyloid formation are processes that can be greatly affected by changes in the protein sequence. Some amyloidoses have been associated with specific mutations, such as transthyretin amyloidosis which has been extensively studied. However, no study has been conducted on mutations found in amyloidogenic proteins as a whole. To fill this gap a study was conducted to evaluate the effect of single nucleotide polymorphisms (SNPs) on amyloidogenic proteins. SNPs are genetic variations that correspond to a variant in a single base position in the DNA and typically must have a frequency of 1% or more in a given population. SNPs can be categorized based on their influence on the protein product. Here the focus was on missense SNPs (msSNPs) that lead to an amino acid substitution. For this study, all known human amyloidogenic proteins were collected. Proteins characterized as precursors (causative) in the Amyloidoses Collection (AmyCo) database were extracted. These were supplemented using the most recent list of amyloidogenic proteins curated by the International Society of Amyloidosis (ISA). Pharmaceutical products not corresponding to human genes and immunoglobins, which are extremely variable, were excluded. Next, three databases were used for the collection of msSNPs regarding these proteins, UniProt, ClinVar, and dbSNP. This data was mapped to the primary protein sequences from UniProt and duplicate entries were removed. All msSNPs were classified using a unified terminology as Pathogenic, Benign or Unclassified depending on their association with disease(s). Additionally, the polymorphisms related specifically to amyloidoses and related phenotypes were isolated, and a subset was created for further analysis. Next, to assess how msSNPs might affect protein aggregation, the aggregation-prone regions of each protein were predicted using AMYLPRED2, a consensus method for predicting amyloidogenic determinants from the protein sequence. Statistical analysis of the collected data was accomplished using three methodologies, each applied where appropriate. First, the chi-squared test was used to determine whether the classification of an msSNP is related to its location in or outside of aggregation-prone regions (APRs). Indeed, aggregation-prone regions were shown to have a larger percentage of pathogenic msSNPs. However, the difference was statistically significant (p<0.05) only for the dataset of amyloidoses-related msSNPs. Next, logistic regression was performed to examine if an amino acid substitution that results in a change in biophysical properties (e.g., polar to non-polar) is related to the pathogenicity status of the msSNP. Most notably, substitutions of a negatively charged residue by any other category were more likely to be pathogenic than benign. Lastly, to estimate the statistical significance of each possible amino acid substitution a bootstrap method was used to theoretically increase the available data in a random and unbiased way. The most frequent substitutions of the pathogenic msSNPs in aggregation-prone regions were that of Glutamic acid by Lysine, Arginine by Histidine, and Leucine by Proline. Lastly, a case study on AD and the critical APP protein was further explored. The results of this work have been presented at conferences and a manuscript has been prepared for publication. (Galanis, F. P., Apostolakou, A. E., et al., In silico study of missense SNPs on Amyloidogenic Proteins)Amyloidoses network Beside the common element of amyloid deposition, amyloidoses and related diseases are diverse in their presentation and biology but also have other common characteristics. Study of these diseases are typically limited to one or few, therefore a study was done on these diseases as a whole in order to identify common elements in their molecular mechanisms. This could help with the fact that most amyloidoses and other diseases related to amyloid deposition have limited treatment options. Drug development is a long and costly process, and this has led to the adoption of strategies to mitigate these issues, such as the use of screening assays. This problem is exacerbated by rare diseases that affect a small number of people and have fewer resources dedicated to studying them. A promising approach for drug development with shorter timelines and lower costs is called drug repurposing; this is essentially the re-purposing of existing drugs for use beyond their scope. In this work, a network of amyloidoses and diseases related to amyloid deposition was constructed. Amyloidogenic proteins and co-deposited proteins were the primary focus, these were collected from the Amyloidoses Collection (AmyCo). This dataset was updated through an extensive literature search, which resulted in an additional disease. The top 100 protein interactors for each protein were programmatically extracted from the STRING database. Drugs targeting any of the proteins in the dataset were collected from DrugBank, a comprehensive database of drugs and drug targets. Furthermore, DrugBank was also used to find drugs indicated for the diseases under study. A network of associations between diseases, proteins and drugs was constructed and visualized using the freely available tool Cytoscape. Finally, the literature was reviewed for any previously established associations between the drugs and the diseases under study and promising drugs and drug targets were identified. A total of 76 diseases caused by or associated with amyloids were studied. The central proteins were found in the network of disease and proteins associated to them that is the precursor and co-deposited proteins. These central proteins corresponded to two amyloid signature proteins and to the two serum amyloid-α proteins that are associated with several inflammatory diseases where secondary amyloidosis can develop. The total network is composed of 76 diseases, 768 proteins and 1,414 drugs. The disease-protein-drug association network was strongly connected with only four diseases being isolated. Less than half of the diseases have available drugs but most of the remaining proteins are indirectly associated to drugs, therefore there is potential for repurposing these drugs. Within this network, important drug targets and their associated drugs were found such as G-protein coupled receptors (GPCRs) and protein kinases. Lastly, the findings from this network analysis can be used to guide experimental studies for discovering treatments for amyloidoses. The results of this work have been presented at conferences and a manuscript has been prepared for publication. (Rizou, A. E. I., Nasi, G. I., Apostolakou, A. E., et al., Integrated network-based analysis of diseases associated with amyloid deposition through a disease-protein-drug network.)Alzheimer’s disease and G-protein Coupled Receptors G-protein coupled receptors (GPCRs) are the largest family of eukaryotic membrane receptors and are responsible for many important physiological functions, such as vision, olfaction, and neurotransmission. GPCRs are considered ideal drug targets and have been implicated in AD, thereby making them subjects of interest for treating AD. As part of this study, the relationship between AD and GPCR signaling was explored computationally. First, the human GPCR signaling network was constructed and made available via a web application that was created and named hGPCRnet. This application was then used to study the muscarinic acetylcholine receptor pathways that are known to be associated with AD pathology. Finally, proteins that are found exclusively in either the M1 or M2 receptor signaling pathway were shown to be prime pharmacological targets for treating AD. The results of this work were published in a peer-reviewed international scientific journal. (Apostolakou, A. E., Baltoumas, F. A., Stravopodis, D. J., & Iconomidou, V. A. (2020). Extended Human G-Protein Coupled Receptor Network: Cell-Type-Specific Analysis of G-Protein Coupled Receptor Signaling Pathway. Journal of proteome research, 19(1), 511–524. https://doi.org/10.1021/acs.jproteome.9b00754)Alzheimer’s disease and drug repurposing One of the most studied amyloidoses is Alzheimer’s disease (AD), the most common type of dementia. AD is a neurodegenerative disease that is characterized by the presence of amyloid plaques, which are composed primarily of amyloid-β peptide, a cleavage product of APP. Even though most attempts to find a treatment for AD have focused on the primary component of amyloid plaques, there has been little to no consideration of the co-deposited proteins. While some of these proteins have an unknown role in AD and may not influence its course, others have been shown to affect amyloid formation and disease progression, such as the molecular chaperone clusterin, and the apolipoprotein E. The aim of this work was to determine if these proteins have potential as therapeutic targets and if any existing drugs that target them can be used for drug repurposing. The proteins found on amyloid plaques were collected from AmyCo. Their protein interactors were retrieved from IntAct, a database of experimentally determined molecular interactions. Next, the drugs targeting the proteins found on amyloid plaques were collected from DrugBank. Additionally, the drugs approved by the FDA for use in AD and their protein targets from DrugBank were gathered. The network of proteins and drugs interacting with the amyloid plaques was constructed and compared to the existing treatments. Lastly, a review of the literature was done to gather information about the drugs that could be repurposed for use in AD. Including the precursor protein APP there was a total of 12 proteins found in amyloid plaques. These interacted with over 500 proteins and 72 drugs forming a large, connected network. Only one co-deposited protein was not targeted by drugs, while APP was the main protein associated with drugs. In fact, the only drug found in the network that is approved by the FDA for the treatment of AD was an anti-amyloid-β monoclonal antibody, with the other AD drugs primarily prescribed as palliative care and therefore not targeting the cause. However, there were several drugs that target proteins central to amyloid plaques that could be useful in combating AD. After literature research, a total of 28 drug candidates were suggested for further investigation. Of these, there were 15 drugs with known association with AD and related processes and 13 drugs with no or limited association with AD. These candidates were not amongst drugs proposed by previous similar studies on AD and therefore support the novelty of this approach. The results of this work have been presented at conferences and a manuscript has been prepared for publication. (Apostolakou, A. E., et al., Co-deposited proteins in Alzheimer's disease as a potential treasure trove for drug repurposing.)Alzheimer’s disease and Caenorhabditis elegans Alzheimer’s disease (AD) is a progressive neurodegenerative disorder with no known treatment and whose pathogenesis has not yet been elucidated. The main pathological hallmarks of AD are amyloid plaques, which are extracellular deposits of fibrils consisting of abnormally folded amyloid-β peptide (Aβ) a cleavage product of amyloid precursor protein (APP), and neurofibrillary tangles composed of intracellular filaments of the microtubule-associated Tau protein. Because of their central role in AD, APP and more recently Tau have been the primary focus of study. However, other biological processes have been connected to AD and are under scrutiny, such as oxidative stress, inflammation and neurotransmission. Evidence has shown that these AD-related processes are interconnected and a number of feedback loops connect and regulate the various pathways. Age-related diseases, such as AD, often require the use of model organisms due to ethical limitations, the large human lifespan, and the slow progression of the disease. Various organisms have been employed to study AD including the commonly used: Caenorhabditis elegans (nematode), Mus musculus (mouse) and Drosophila melanogaster (fruit fly). How appropriate an organism is to model a specific disease is in part dependent on how similar the relevant proteins and pathways are between the model and the human. System biology approaches, such as protein-protein interaction networks, can reveal the similarities and differences in AD-related pathways between humans and the organisms used to study this disease. As part of this doctoral study, computational methods were applied to the study of AD and the amyloidogenic proteins involved, APP and Tau. More specifically, a comparison of AD-related pathways between Homo sapiens and C. elegans was made using a network alignment approach. Protein interaction data were collected from the STRING and IntAct databases. C. elegans proteins and their human orthologs were extracted from WormBase, a database about nematode biology curated by experts. The networks were created and visualized using Cytoscape and multiple network alignment algorithms were tested. Key conserved processes in the two organisms were the APP processing and Tau phosphorylation pathways. Finally, a number of conserved interactions and specific proteins were identified as potential targets of experimental studies in C. elegans. The results of this work were published in a peer-reviewed international scientific journal. (Apostolakou, A. E., Sula, X. K., Nastou, K. C., Nasi, G. I., & Iconomidou, V. A. (2021). Exploring the conservation of Alzheimer-related pathways between H. sapiens and C. elegans: a network alignment approach. Scientific reports, 11(1), 4572. https://doi.org/10.1038/s41598-021-83892-9)ConclusionsAs part of this doctoral dissertation studies were conducted regarding the entirety of human amyloidogenic proteins, as well as studies focused on Alzheimer's disease. Relevant data from biological databases and the scientific literature, such as genetic polymorphisms or molecular interactions, were analyzed with the use of computational methods and tools. These works could be further expanded through computational studies, such as a structural analysis of polymorphisms, comparison of Alzheimer-related networks between human and other model organisms, as well as study of other diseases related to protein aggregation. Furthermore, these results must be validated experimentally and for this reason many targets of study are suggested, including drugs with potential for repurposing and C. elegans interactions. Lastly, to facilitate future studies the majority of the collected resulting data is available through web applications.

Υπό μη-φυσιολογικές συνθήκες, πολλές πρωτεΐνες αδυνατούν να αποκτήσουν ή να διατηρήσουν τη φυσιολογική τους στερεοδιάταξη και οδηγούνται σε μία εναλλακτική, μη-φυσιολογική στερεοδιάταξη. Παρόλο που τα κύτταρα έχουν μηχανισμούς διατήρησης της πρωτεϊνικής ομοιόστασης, αυτοί μπορούν να αποτύχουν με αποτέλεσμα τη συσσώρευση λάθος διπλωμένων πρωτεϊνών. Οι λάθος διπλωμένες πρωτεΐνες μπορούν να συγκροτήσουν είτε άμορφα είτε οργανωμένα συσσωματώματα, με τα τελευταία να ονομάζονται αμυλοειδή ινίδια. Εύρος ασθενειών, γνωστών ως αμυλοειδώσεις, προκαλούνται από την εναπόθεση αμυλοειδών ινιδίων και αποτελούν υποκατηγορία των στερεοδιαταξικών ασθενειών. Παραδείγματα αμυλοειδώσεων συμπεριλαμβάνουν νευροεκφυλιστικές ασθένειες, όπως η νόσος του Alzheimer και η νόσος του Parkinson, ο διαβήτης τύπου 2 και η αμυλοείδωση της τρανσθυρετίνης. Τουλάχιστον 38 διαφορετικές πρωτεΐνες και πεπτίδια έχουν βρεθεί να συγκροτούνται σε παθολογικά αμυλοειδή στον άνθρωπο, είτε στη φυσική ή τη μεταλλαγμένη μορφή τους. Οι αμυλοειδείς εναποθέσεις που σχηματίζονται από αυτές τις αμυλοειδογόνες πρωτεΐνες μπορεί να περιέχουν άλλες πρωτεΐνες. Ο ρόλος αυτών των συνεναποτεθειμένων πρωτεϊνών στην ασθένεια είναι υπό διερεύνηση. Η πρωτεϊνική συσσωμάτωση μπορεί να επηρεαστεί από διάφορους παράγοντες, όπως το στρες ή οι μεταλλαγές, που προκαλούν το λάθος δίπλωμα και τη συσσώρευση ορισμένων πρωτεϊνών. Οι αμυλοειδογόνες πρωτεΐνες, ή πρωτεΐνες με τάση σχηματισμού αμυλοειδών ινιδίων, αποτελούν ένα μοναδικό σύνολο πρωτεϊνών που διαφέρουν τόσο στη φυσιολογική αλληλουχία όσο και στη φυσιολογική δομή τους, έχουν όμως παρόμοια μορφολογικά και δομικά χαρακτηριστικά στη μορφή των αμυλοειδών ινιδίων. Πειραματικές μελέτες έχουν δείξει ότι εντός της αλληλουχίας αυτών των πρωτεϊνών υπάρχουν μικρά πεπτιδικά τμήματα που χαρακτηρίζονται ως περιοχές με τάση προς συσσωμάτωση. Αυτές οι περιοχές βρίσκονται κρυμμένες εντός της πρωτεΐνης, αλλά όταν η πρωτεΐνη διπλώσει με λανθασμένο τρόπο μπορούν να γίνουν εκτεθειμένες και να οδηγήσουν στον σχηματισμό συσσωματωμάτων. Εφόσον αυτές οι περιοχές συμμετέχουν ενεργά κατά τη διάρκεια συγκρότησης των αμυλοειδών ινιδίων, είναι, επομένως, λογικό να συνδεθούν με τις αμυλοειδώσεις.Πολλές αμυλοειδώσεις, συμπεριλαμβανομένου της ιδιαίτερα μελετημένης νόσου του Alzheimer, στερούνται καλά καθορισμένα διαγνωστικά κριτήρια και έχουν λίγες ή καθόλου αποτελεσματικές θεραπείες. Δεδομένης της δυσκολίας και των περιορισμών στις ανθρώπινες μελέτες, οι ερευνητές συχνά βασίζονται σε οργανισμούς μοντέλα και in vitro πειράματα για να μελετήσουν αυτές τις ασθένειες. Υπολογιστικά εργαλεία και μελέτες προσφέρουν ανεκτίμητη καθοδήγηση για τέτοια πειράματα περιορίζοντας την πληθώρα στόχων. Βάσεις δεδομένων προσφέρουν εύκολη πρόσβαση σε έναν όλο και αυξανόμενο όγκο δεδομένων, όπως είναι οι γενετικοί πολυμορφισμοί ή οι μοριακές αλληλεπιδράσεις. Προγνωστικοί αλγόριθμοι μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τον προσδιορισμό περιοχών με τάση προς συσσωμάτωση εντός των αλληλουχιών αμυλοειδογόνων πρωτεϊνών. Τα βιολογικά δίκτυα μπορούν να δώσουν μία εικόνα σε επίπεδο συστήματος απαραίτητη για τη μελέτη των περίπλοκων μηχανισμών ασθένειας, η οποία θα ήταν ανέφικτη χωρίς υπολογιστικές μεθόδους.Έμφαση δόθηκε στη μελέτη της νόσου του Alzheimer που αποτελεί την πιο κοινή μορφή άνοιας. Παθολογικά χαρακτηριστικά της νόσου είναι οι αμυλοειδείς πλάκες και τα νευροϊνιδιακά δεμάτια. Οι αμυλοειδείς πλάκες δημιουργούνται από την εξωκυτταρική εναπόθεση του αμυλοειδούς-β πεπτιδίου, το οποίο είναι προϊόν πρωτεολυτικής επεξεργασίας της πρόδρομης πρωτεΐνης του αμυλοειδούς-β (Amyloid Precursor Protein, APP). Τα νευροϊνιδιακά δεμάτια είναι ενδοκυτταρικά έγκλειστα της υπερφωσφορυλιωμένης σχετιζόμενης με μικροσωληνίσκους πρωτεΐνης Tau. Παρόλο που αναζητείται θεραπεία της νόσου για δεκαετίες, μόλις πρόσφατα εγκρίθηκαν νέα φάρμακα τα οποία, δυστυχώς, έχουν περιορισμένη απόδοση και σχετίζονται με σοβαρές παρενέργειες.Ένας πλούτος γνώσεων έχει συλλεχθεί για την πρωτεϊνική συσσωμάτωση και την αμυλοειδογονικότητα, και όμως, πολλές ερωτήσεις παραμένουν αναπάντητες. Επομένως, ο στόχος αυτής της διδακτορικής διατριβής που εκπονήθηκε στον Τομέα Βιολογίας Κυττάρου και Βιοφυσικής υπό την επίβλεψη της Αναπληρώτριας Καθηγήτριας Βασιλικής Οικονομίδου, ήταν να πραγματοποιηθούν υπολογιστικές μελέτες που θα βοηθήσουν στο να απαντηθούν κάποιες από τις υπάρχοντες ερωτήσεις σχετικά με την πρωτεϊνική συσσωμάτωση και την αμυλοειδογονικότητα. Η συστημική διερεύνηση των αμυλοειδογόνων πρωτεϊνών ή των πρωτεϊνών που σχετίζονται με την πρωτεϊνική συσσωμάτωση επιτεύχθηκε με τη χρήση υπολογιστικών μεθοδολογιών. Χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι η ανάλυση βιολογικών δικτύων που χρησιμοποιήθηκε για να διερευνηθούν οι σχέσεις που διέπουν την αμυλοειδογονικότητα, να συγκριθούν οι μοριακοί μηχανισμοί που σχετίζονται με ασθένεια σε άνθρωπο και οργανισμό μοντέλο, και να προσδιοριστούν υποσχόμενα φάρμακα και στόχοι φαρμάκων. Ο απώτερος στόχος της διατριβής ήταν, μέσω της υπολογιστικής μελέτης των αμυλοειδογόνων πρωτεϊνών και των μηχανισμών συσσωμάτωσης, να συμμετέχει μαζί με πειραματικές προσεγγίσεις στη διάγνωση και θεραπεία των αμυλοειδώσεων.Τα αποτελέσματα αυτής της διδακτορικής διατριβής έχουν χωριστεί σε πέντε θέματα, με κάθε θέμα να αντιστοιχεί σε μία δημοσιευμένη, κατατεθειμένη ή έτοιμη για κατάθεση επιστημονική εργασία.Αμυλοειδογόνες πρωτεΐνες και πολυμορφισμοίΗ πρωτεϊνική συσσωμάτωση και ο σχηματισμός αμυλοειδών είναι δύο διαδικασίες που επηρεάζονται σημαντικά από αλλαγές στην πρωτεϊνική αλληλουχία. Κάποιες αμυλοειδώσεις έχουν συσχετιστεί με συγκεκριμένες μεταλλαγές, όπως η καλά μελετημένη αμυλοείδωση της τρανσθυρετίνης. Όμως, καμία μελέτη δεν είχε πραγματοποιηθεί στο σύνολο των μεταλλαγών ή πολυμορφισμών όλων των αμυλοειδογόνων πρωτεϊνών. Για να καλυφθεί αυτό το κενό, πραγματοποιήθηκε μία μελέτη για να εξεταστεί η επίδραση των μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών (single nucleotide polymorphisms, SNPs) στις αμυλοειδογόνες πρωτεΐνες. Οι SNPs είναι γενετικοί πολυμορφισμοί που αντιστοιχούν σε αλλαγή μίας νουκλεοτιδικής βάσης στο DNA και τυπικά πρέπει να έχουν πάνω από 1% συχνότητα στο δεδομένο πληθυσμό. Οι SNPs μπορούν να κατηγοριοποιηθούν βάσει της επίδρασης τους στην παραγόμενη πρωτεΐνη. Στην παρούσα διατριβή, το επίκεντρο ήταν οι μη-συνώνυμοι SNPs (msSNPs) που οδηγούν σε αντικατάσταση ενός αμινοξικού καταλοίπου.Για αυτή τη μελέτη, συλλέχθηκαν όλες οι γνωστές αμυλοειδογόνες πρωτεΐνες του ανθρώπου. Από την AmyCo, μία καλά σχολιασμένη συλλογή αμυλοειδώσεων, ληφθήκαν οι πρωτεΐνες χαρακτηρισμένες ως πρόδρομες (precursor). Αυτή η λίστα συμπληρώθηκε με τις αμυλοειδογόνες πρωτεΐνες από την πιο πρόσφατη επίσημη λίστα της Διεθνούς Ένωσης των Αμυλοειδώσεων (International Society of Amyloidosis, ISA). Αποκλείστηκαν φαρμακευτικά προϊόντα που δεν αντιστοιχούν σε πρωτεΐνες του ανθρώπου και οι ανοσοσφαιρίνες που ποικίλουν σε επίπεδο αλληλουχίας. Μετά, η συλλογή των msSNPs που βρίσκονται σε αυτές τις πρωτεΐνες έγινε από τρεις βάσεις δεδομένων, τη UniProt, τη ClinVar και τη dbSNP. Τα δεδομένα αυτά χαρτογραφήθηκαν στην κανονική σύμφωνα με τη UniProt πρωτεϊνική αλληλουχία και οι διπλές εγγραφές αφαιρέθηκαν. Όλοι οι SNPs κατηγοριοποιήθηκαν σύμφωνα με μία ενιαία ορολογία ως Παθολογικοί, Ουδέτεροι ή Μη χαρακτηρισμένοι, ανάλογα με τη συσχέτιση τους με ασθένειες. Ακόμα, απομονώθηκαν οι πολυμορφισμοί που σχετίζονται ειδικά με αμυλοειδώσεις και σχετικούς φαινότυπους και δημιουργήθηκε ένα υποσύνολο για περαιτέρω μελέτη. Έπειτα, για να διερευνηθεί το πώς οι msSNPs μπορούν να επιδράσουν στην πρωτεϊνική συσσωμάτωση, οι περιοχές με τάση προς συσσωμάτωση της κάθε πρωτεΐνης προβλέφθηκαν χρησιμοποιώντας το AMYLPRED2, μία συναινετική μέθοδο πρόγνωσης αμυλοειδογόνων καθοριστών από την πρωτεϊνική αλληλουχία.Πραγματοποιήθηκαν οι κατάλληλες ανά περίπτωση στατιστικές αναλύσεις χρησιμοποιώντας τρεις μεθοδολογίες. Πρώτα, ο στατιστικός έλεγχος Χ2 χρησιμοποιήθηκε για να βρεθεί αν η κατηγοριοποίηση ενός msSNP σχετίζεται με τη θέση του εντός ή εκτός περιοχών με τάση προς συσσωμάτωση. Όντως, φάνηκε ότι οι περιοχές με τάση προς συσσωμάτωση εμφανίζουν μεγαλύτερο ποσοστό παθολογικών msSNPs. Όμως, αυτή η διαφορά ήταν στατιστικά σημαντική (p<0.05) μόνο για το σύνολο των σχετιζόμενων με αμυλοειδώσεις msSNPs. Σε επόμενο βήμα, έγινε λογιστική παλινδρόμηση για να διερευνηθεί αν οι αμινοξικές αντικαταστάσεις που προκαλούν αλλαγή των βιοφυσικών ιδιοτήτων (π.χ., πολικό σε μη-πολικό) σχετίζονται με το χαρακτηρισμό των msSNPs σε σχέση με ασθένειες. Κυρίως φάνηκε ότι η αλλαγή αρνητικά φορτισμένου καταλοίπου από μη-αρνητικά φορτισμένο κατάλοιπο ήταν πιο πιθανό να είναι παθολογική, γεγονός που ενδέχεται να σχετίζεται με την ιδιότητα αρνητικών καταλοίπων να δρουν ως αναστολής της πρωτεϊνικής συσσωμάτωσης. Έπειτα, για να υπολογιστεί η στατιστική σημαντικότητα κάθε πιθανής αμινοξικής αντικατάστασης, χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος bootstrap για να προσομοιωθεί αύξηση των υπαρχόντων δεδομένων με ένα τυχαίο και μη-μεροληπτικό τρόπο. Εντός του συνόλου των παθολογικών msSNPs που βρίσκονται σε περιοχές με τάση προς συσσωμάτωση, εμφανίστηκαν ως πιο συχνές οι αντικαταστάσεις γλουταμικού οξέος από λυσίνη, αργινίνη από ιστιδίνη και λευκίνη από προλίνη. Τέλος, η νόσος του Alzheimer και η πρωτεΐνη APP χρησιμοποιήθηκαν ως παράδειγμα μελέτης για να αναδειχθεί πως οι msSNPs επηρεάζουν τη συσσωμάτωση. Ενδιαφέρον είχε το γεγονός ότι πολλοί πολυμορφισμοί μετέβαλαν την αλληλεπίδραση της APP με άλλες πρωτεΐνες, συγκεκριμένα πρωτεολυτικά ένζυμα επεξεργασίας της.Τα αποτελέσματα αυτά έχουν παρουσιαστεί σε συνέδρια και μία επιστημονική εργασία έχει προετοιμαστεί. (Galanis, F. P., Apostolakou, A. E., et al., In silico study of missense SNPs on Amyloidogenic Proteins)Δίκτυο αμυλοειδώσεωνΠέρα από το κοινό στοιχείο της εναπόθεσης αμυλοειδών, οι αμυλοειδώσεις και άλλες σχετικές ασθένειες ποικίλουν τόσο στην εμφάνιση όσο και στη βιολογία τους αλλά έχουν και κοινά χαρακτηριστικά. Μελέτες αυτών των ασθενειών είναι συνήθως περιορισμένες σε μία ή λίγες από αυτές, για αυτό πραγματοποιήθηκε μία μελέτη που αφορά το σύνολό τους σε προσπάθεια να βρεθούν κοινά στοιχεία ανάμεσα στους μοριακούς μηχανισμούς των ασθενειών. Αυτή μπορεί να βοηθήσει να βρεθεί λύση στο ότι οι περισσότερες αμυλοειδώσεις και άλλες ασθένειες που σχετίζονται με την εναπόθεση αμυλοειδών έχουν περιορισμένες θεραπευτικές επιλογές. Η ανάπτυξη φαρμάκων είναι μία χρονοβόρος και δαπανηρή διαδικασία και για αυτό χρησιμοποιούνται στρατηγικές αντιμετώπισης αυτών των εμποδίων. Το πρόβλημα εντείνεται όσον αφορά τις σπάνιες παθήσεις που θίγουν μικρό αριθμό ατόμων και υπάρχουν περιορισμένα εφόδια για τη μελέτη τους. Μία υποσχόμενη προσέγγιση για την εύρεση φαρμάκων σε συντομότερα χρονικά πλαίσια και με χαμηλότερο κόστος είναι η επαναστόχευση φαρμάκων. Μέσω αυτής βρίσκονται καινούργιες εφαρμογές για ήδη υπάρχοντα φάρμακα πέρα του αρχικού τους στόχου. Σε αυτή την εργασία κατασκευάστηκε ένα δίκτυο αμυλοειδώσεων και άλλων ασθενειών που σχετίζονται με την εναπόθεση αμυλοειδών. Έμφαση δόθηκε στις πρωτεΐνες που βρίσκονται στις εναποθέσεις της κάθε ασθένειας, αμυλοειδογόνες και συνεναποτεθειμένες, οι οποίες συλλέχθηκαν από την AmyCo. Αυτό το σύνολο ανανεώθηκε μετά από ενδελεχή βιβλιογραφική αναζήτηση, με αποτέλεσμα την προσθήκη μίας ασθένειας. Για κάθε πρωτεΐνη του συνόλου, συλλέχθηκαν οι 100 πρώτοι γείτονες με την καλύτερη βαθμολογία από τη βάση δεδομένων πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων STRING. Φάρμακα που στοχεύουν σε κάποια από τις πρωτεΐνες του συνόλου συλλέχθηκαν από τη βάση DrugBank που περιέχει δεδομένα για φάρμακα και στόχους φαρμάκων. Από αυτή τη βάση βρέθηκαν και όλα τα φάρμακα που σχετίζονται με τις υπό μελέτη ασθένειες. Συγκροτήθηκε ένα δίκτυο συσχετίσεων μεταξύ ασθενειών, πρωτεϊνών και φαρμάκων το οποίο οπτικοποιήθηκε μέσω του ελεύθερα διαθέσιμου εργαλείου Cytoscape. Τέλος, έγινε βιβλιογραφική αναζήτηση για ήδη υπάρχουσες συσχετίσεις μεταξύ ασθενειών και φαρμάκων και αναγνωρίστηκαν υποσχόμενα φάρμακα και στόχοι τους για τη θεραπεία των αμυλοειδώσεων.Μελετήθηκαν συνολικά 76 ασθένειες που είναι αμυλοειδώσεις ή σχετίζονται με την εναπόθεση αμυλοειδών. Το δίκτυο ήταν ισχυρά συνδεδεμένο, με μόνο τέσσερις ασθένειες να είναι μεμονωμένες. Βρέθηκαν οι κεντρικές πρωτεΐνες στο δίκτυο των ασθενειών και των πρωτεϊνών που σχετίζονται άμεσα με αυτές, δηλαδή οι πρόδρομες και συνεναποτεθειμένες πρωτεΐνες. Αυτές αντιστοιχούσαν σε δύο πρωτεΐνες υπογραφής αμυλοειδών εναποθέσεων (amyloid signature proteins) και στις δύο πρωτεΐνες του αμυλοειδούς Α του ορού που σχετίζονται με πληθώρα φλεγμονωδών νόσων όπου μπορεί να εμφανιστεί δευτερογενής αμυλοείδωση. Το ολικό δίκτυο ασθενειών-πρωτεϊνών-φαρμάκων αποτελούνταν συνολικά από 76 ασθένειες, 768 πρωτεΐνες και 1,414 φάρμακα. Λιγότερες από τις μισές ασθένειες έχουν διαθέσιμα φάρμακα αλλά πολλές από τις υπόλοιπες σχετίζονται έμμεσα με φάρμακα. Επομένως, ίσως υπάρχει δυνατότητα επαναστόχευσης φαρμάκων για τη θεραπεία τους. Εντός του δικτύου βρέθηκαν σημαντικοί στόχοι φαρμάκων και φάρμακα που στοχεύουν σε αυτούς όπως είναι οι συζευγμένοι με G-πρωτεΐνες υποδοχείς (G-protein coupled receptors, GPCRs) και οι πρωτεϊνικές κινάσες. Τέλος, τα ευρήματα από αυτό το δίκτυο μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να καθοδηγήσουν πειραματικές μελέτες για την εύρεση θεραπειών για τις αμυλοειδώσεις. Τα αποτελέσματα αυτά έχουν παρουσιαστεί σε συνέδρια και μία επιστημονική εργασία έχει προετοιμαστεί. (Rizou, A. E. I., Nasi, G. I., Apostolakou, A. E., et al., Integrated network-based analysis of diseases associated with amyloid deposition through a disease-protein-drug network.)Η νόσος του Alzheimer και οι Συζευγμένοι με G-πρωτεΐνες υποδοχείςΜία από τις πιο σημαντικές πρωτεϊνικές οικογένειες ως θεραπευτικοί στόχοι είναι οι GPCRs. Αποτελούν τη μεγαλύτερη οικογένεια ευκαρυωτικών μεμβρανικών υποδοχέων και είναι υπεύθυνοι για φυσιολογικές λειτουργίες, όπως η όραση, η όσφρηση και η νευροδιαβίβαση. Θεωρούνται ως ιδανικοί στόχοι φαρμάκων και έχουν συσχετιστεί με διάφορες ασθένειες, συμπεριλαμβανομένης και της νόσου του Alzheimer. Σε αυτή τη μελέτη διερευνήθηκε υπολογιστικά η σχέση των GPCRs και της νόσου του Alzheimer. Πρώτα, κατασκευάστηκε το ανθρώπινο σηματοδοτικό δίκτυο των GPCRs και δημιουργήθηκε μία διαδικτυακή εφαρμογή που επιτρέπει την εξερεύνησή του. Αυτή η εφαρμογή, που ονομάστηκε hGPCRnet, χρησιμοποιήθηκε για να μελετηθούν τα μονοπάτια των μουσκαρινικών υποδοχέων ακετυλοχολίνης που είναι γνωστό ότι σχετίζονται με τη νόσο του Alzheimer. Τελικά, βρέθηκαν πρωτεΐνες που είναι πιθανοί στόχοι για τη θεραπεία της νόσου, όπως είναι οι σηματοδοτικές πρωτεΐνες που βρίσκονται αποκλειστικά στο μονοπάτι του Μ1 ή του Μ2 υποδοχέα ακετυλοχολίνης.Τα αποτελέσματα αυτά έχουν δημοσιευθεί σε περιοδικό με σύστημα κριτών. (Apostolakou, A. E., Baltoumas, F. A., Stravopodis, D. J., & Iconomidou, V. A. (2020). Extended Human G-Protein Coupled Receptor Network: Cell-Type-Specific Analysis of G-Protein Coupled Receptor Signaling Pathway. Journal of proteome research, 19(1), 511–524. https://doi.org/10.1021/acs.jproteome.9b00754)Η νόσος του Alzheimer και η επαναστόχευση φαρμάκωνΜία από τις πιο καλά μελετημένες αμυλοειδώσεις είναι η νόσος του Alzheimer που χαρακτηρίζεται από την εναπόθεση του αμυλοειδούς-β σε αμυλοειδείς πλάκες. Πολλές προσπάθειες εύρεσης θεραπείας για τη νόσο έχουν εστιαστεί στο κύριο συστατικό των αμυλοειδών πλακών, αλλά λίγοι έχουν ασχοληθεί με τις συνεναποτεθειμένες πρωτεΐνες. Παρόλο που κάποιες από αυτές έχουν άγνωστο ως τώρα ρόλο, άλλες έχει δειχθεί ότι επηρεάζουν τον σχηματισμό αμυλοειδών και την πρόοδο της ασθένειας, όπως η μοριακή συνοδός κλαστερίνη και η απολιποπρωτεΐνη Ε. Ο στόχος αυτής της εργασίας ήταν να προσδιοριστεί αν αυτές οι πρωτεΐνες είναι πιθανοί θεραπευτικοί στόχοι και αν υπάρχοντα φάρμακα που στοχεύουν σε αυτές μπορούν να επαναστοχευθούν.Οι πρωτεΐνες που βρίσκονται στις αμυλοειδείς πλάκες συλλέχθηκαν από την AmyCo. Οι πρωτεΐνες με τις οποίες αλληλεπιδρούν άμεσα (πρώτοι γείτονες) αναζητήθηκαν στην IntAct, βάση πειραματικά επιβεβαιωμένων μοριακών αλληλεπιδράσεων. Έπειτα, τα φάρμακα που στοχεύουν στις πρωτεΐνες που βρίσκονται στις αμυλοειδείς πλάκες βρέθηκαν μέσω της DrugBank. Επιπρόσθετα, τα εγκεκριμένα φάρμακα από τον FDA για χρήση στη νόσο του Alzheimer και οι πρωτεΐνες που στοχεύουν συλλέχθηκαν από τη DrugBank. Δημιουργήθηκε το δίκτυο αλληλεπιδράσεων φαρμάκων και πρωτεϊνών που σχετίζονται με τις αμυλοειδείς πλάκες και συγκρίθηκαν με τις υπάρχουσες θεραπείες. Τέλος, έγινε βιβλιογραφική ανασκόπηση για τη συλλογή πληροφοριών σχετικά με τα φάρμακα του δικτύου που θα μπορούσαν να επαναστοχευθούν για χρήση στη νόσο του Alzheimer.Συνολικά βρέθηκαν 12 πρωτεΐνες στις αμυλοειδείς πλάκες, συμπεριλαμβανομένης της APP. Αυτές αλληλεπιδρούν με παραπάνω από 500 πρωτεΐνες και 72 φάρμακα για να σχηματίσουν ένα μεγάλο συνδεδεμένο δίκτυο. Μόνο μία συνεναποτεθειμένη πρωτεΐνη δεν στοχεύεται από φάρμακο, ενώ η APP ήταν η κύρια πρωτεΐνη στόχος φαρμάκων. Μάλιστα, τα μόνα φάρμακα εντός του δικτύου που είναι εγκεκριμένα για χρήση στη νόσο ήταν δύο μονοκλωνικά αντισώματα έναντι του β-αμυλοειδούς. Τα υπόλοιπα φάρμακα για τη νόσο χρησιμοποιούνται κυρίως για την ανακούφιση των συμπτωμάτων και επομένως δε στοχεύουν την αιτία της νόσου. Όμως, υπάρχουν πολλά φάρμακα που στοχεύουν τις πρωτεΐνες που βρίσκονται στις αμυλοειδείς πλάκες, τα οποία ίσως είναι χρήσιμα για την αντιμετώπιση της νόσου του Alzheimer, και έπειτα από βιβλιογραφική ανασκόπηση συγκροτήθηκε μία λίστα 28 υποσχόμενων φαρμάκων για περαιτέρω εξερεύνηση. Από αυτά, τα 15 έχουν γνωστές συσχετίσεις με τη νόσο και σχετιζόμενες διεργασίες, ενώ τα υπόλοιπα 13 δεν έχουν καλά γνωστή σχέση με τη νόσο. Αυτά τα προτεινόμενα φάρμακα δεν έχουν προταθεί από παρόμοιες προηγούμενες μελέτες, επιβεβαιώνοντας την πρωτοπορία της προσέγγισης. Τα αποτελέσματα αυτά έχουν παρουσιαστεί σε συνέδρια και μία επιστημονική εργασία έχει προετοιμαστεί. (Apostolakou, A. E., et al., Co-deposited proteins in Alzheimer's disease as a potential treasure trove for drug repurposing.)Η νόσος του Alzheimer και ο Caenorhabditis elegansΗ νόσος του Alzheimer χαρακτηρίζεται από τις αμυλοειδείς πλάκες και τα νευροϊνιδιακά δεμάτια. Άλλες βιολογικές διεργασίες που έχουν συσχετισθεί με τη νόσο συμπεριλαμβάνουν το οξειδωτικό στρες, τη φλεγμονή και τη νευροδιαβίβαση. Ακόμα, υπάρχουν ενδείξεις ότι οι σχετικές με τη νόσο διεργασίες είναι διασυνδεδεμένες και υπάρχουν διάφοροι ανατροφοδοτικοί βρόχοι που συνδέουν και ρυθμίζουν τα διάφορα μονοπάτια. Για τη μελέτη των διεργασιών που διέπουν ασθένειες του γήρατος, όπως είναι η νόσος του Alzheimer, απαιτείται η χρήση οργανισμών μοντέλων λόγω των ηθικών περιορισμών, της μακράς διάρκειας ζωής του ανθρώπου και της αργής προόδου της ασθένειας. Διάφοροι οργανισμοί έχουν χρησιμοποιηθεί για τη μελέτη της νόσου του Alzheimer όπως: Caenorhabditis elegans (νηματώδης σκώληκας), Mus musculus (ποντίκι) and Drosophila melanogaster (φρουτόμυγα). Το πόσο κατάλληλος είναι ένας οργανισμός για τη μοντελοποίηση μίας νόσου εξαρτάται εν μέρει από το πόσο παρόμοιες είναι οι σχετικές πρωτεΐνες και τα μονοπάτια μεταξύ μοντέλου και ανθρώπου. Προσεγγίσεις βιολογίας συστημάτων, όπως τα δίκτυα πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων, μπορούν να αποκαλύψουν τις ομοιότητες και τις διαφορές σε μονοπάτια που σχετίζονται με τη νόσο μεταξύ ανθρώπου και του οργανισμού που επιλέχθηκε για τη μελέτη.Χρησιμοποιήθηκαν υπολογιστικές μέθοδοι για τη μελέτη της νόσου του Alzheimer και των σχετιζόμενων αμυλοειδογόνων πρωτεϊνών, APP και Tau. Πιο συγκεκριμένα, πραγματοποιήθηκαν συγκρίσεις των σχετικών με τη νόσο μονοπατιών μεταξύ Homo sapiens και C. elegans. Πρώτα, κατασκευάστηκαν δίκτυα για τους δύο οργανισμούς με δεδομένα πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων από βάσεις, όπως η STRING και η IntAct. Πληροφορίες για τις πρωτεΐνες του C. elegans και αντίστοιχες ορθόλογες πρωτεΐνες του ανθρώπου αναζητήθηκαν στη WormBase, βάση για τη βιολογία των νηματόδων σκωλήκων, και μέσω του εργαλείου ορθολογίας OrthoList2. Τα δίκτυα οπτικοποιήθηκαν μέσω του Cytoscape και συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας αλγορίθμους στοίχισης δικτύων. Συνολικά πραγματοποιήθηκαν τρεις προσεγγίσεις, μία για την επιλογή του καλύτερου αλγορίθμου, μία για επιβεβαίωση και τέλος μία μη-μεροληπτική. Τελικά, βρέθηκαν καλά συντηρημένες πρωτεΐνες και μεταξύ τους αλληλεπιδράσεις που σχετίζονταν με την επεξεργασία της APP και με τη φωσφορυλίωση της Tau. Σημαντική είναι η έλλειψη πληροφοριών για τις αλληλεπιδράσεις στον οργανισμό μοντέλο, για τις περισσότερες εκ των οποίων δε βρέθηκαν πληροφορίες στη βιβλιογραφία. Επομένως, προτείνονται διάφορες σχετικές με τη νόσο πρωτεΐνες και αλληλεπιδράσεις για περαιτέρω πειραματική μελέτη. Για τη διευκόλυνση αυτής της διαδικασίας δημιουργήθηκε μία διαδικτυακή εφαρμογή.Τα αποτελέσματα αυτά έχουν δημοσιευθεί σε περιοδικό με σύστημα κριτών. (Apostolakou, A. E., Sula, X. K., Nastou, K. C., Nasi, G. I., & Iconomidou, V. A. (2021). Exploring the conservation of Alzheimer-related pathways between H. sapiens and C. elegans: a network alignment approach. Scientific reports, 11(1), 4572. https://doi.org/10.1038/s41598-021-83892-9)ΣυμπεράσματαΣτα πλαίσια αυτής της διδακτορικής διατριβής πραγματοποιήθηκαν μελέτες που αφορούσαν το σύνολο των αμυλοειδογόνων πρωτεϊνών του ανθρώπου, καθώς και μελέτες που επικεντρώθηκαν στη νόσο του Alzheimer. Μέσω της χρήσης υπολογιστικών μεθόδων και εργαλείων έγινε ανάλυση σχετικών δεδομένων από βάσεις δεδομένων και τη βιβλιογραφία, όπως δεδομένων γενετικών πολυμορφισμών ή μοριακών αλληλεπιδράσεων. Οι εργασίες μπορούν να επεκταθούν περαιτέρω μέσω υπολογιστικών μεθόδων, για παράδειγμα δομική μελέτη πολυμορφισμών, σύγκριση δικτύων σχετικά με τη νόσο του Alzheimer ανθρώπου και άλλων οργανισμών μοντέλων, καθώς και μελέτη άλλων ασθενειών που σχετίζονται με την πρωτεϊνική συσσωμάτωση. Ακόμα, τα αποτελέσματα πρέπει να επιβεβαιωθούν πειραματικά και για αυτό το λόγο προτείνονται διάφοροι στόχοι μελέτης, όπως φάρμακα που μπορούν να επαναστοχευθούν και αλληλεπιδράσεις του οργανισμού μοντέλου C. elegans. Τέλος, για τη διευκόλυνση μελλοντικών ερευνών, η πλειοψηφία των τελικών δεδομένων είναι διαθέσιμη μέσω διαδικτυακών εφαρμογών.