Drug design of novel selective inhibitors targeting lipoxygenase enzyme and molecular study on the mechanism of action of anti-hypertensive drugs

Abstract

In this thesis we employed a combination of theoretical and experimental methods to investigate the molecular activity of potent and commercially available drugs. In the first axis of this thesis, in silico calculations have been performed to discover potential inhibitors targeting human 5-lipoxygenase (5-LOX). 5-LOX is a popular enzyme responsible for the release of pro-inflammatory agents in the cell. It is associated to a variety of different diseases, such as asthma, Alzheimer’s and cancer, while the only commercially available inhibitor targeting the enzyme and prescribed for the treatment of asthma, zileuton, shows an unfavorable pharmacokinetic profile and causes liver toxicity. Thus, our aim was to discover novel compounds targeting 5-LOX that bind to the enzyme in the same manner as zileuton. The rationale for designing these compounds commenced by repurposing all the natural and artificial sweeteners for their action towards LOX, where aspartame was discovered as the most prominent LOX inhibitor. To eliminate aspartame’s metabolic products because of concerns for their safety, we designed a series of 12 compounds based on aspartame’s structural part that were evaluated with in silico and in vitro methods. The results pinpointed that two of the compounds could exert significant inhibitory activity towards 5-LOX. In the second axis of this thesis, the commercially available antihypertensive drug, irbesartan, was studied aiming to improve its pharmacological profile and unveil insights concerning its mechanism of action. The predominant hypothesis for the latter suggests that the drug initially enters the membrane and then slowly diffuses towards its receptor, rather than directly entering to the transmembrane receptor. Hence, irbesartan was encapsulated in a 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin carrier to improve its pharmacological profile, while its molecular interactions as well as its release to the lipid bilayers were investigated using in silico and NMR methods. Finally, this investigation pinpointed irbesartan’s release from the cyclodextrin carrier, while the most prominent conformation of the drug into the lipid bilayers was unveiled.

Σε αυτήν τη διδακτορική διατριβή εφαρμόστηκε ένας συνδυασμός πειραματικών και υπολογιστικών μεθόδων με στόχο να ερευνηθεί η μοριακή δράση υποψηφίων και εμπορικά διαθέσιμων φαρμάκων. Όσον αφορά τον πρώτο άξονα της διατριβής, εκτέστηκαν in silico υπολογισμοί για την ανακάλυψη νέων μορίων-αναστολέων της 5-λιποξυγονάσης (5-LOX). H 5-LOX αποτελεί ένα ένζυμο που ευθύνεται για την απελευθέρωση πρόδρομων μορίων της φλεγμονής στο κύτταρο. Σχετίζεται με πολλές διαφορετικές ασθένειες, όπως το άσθμα, η νόσος Αλτσχάιμερ και ο καρκίνος, ενώ ο μόνος εμπορικά διαθέσιμος αναστολέας του ενζύμου, ο οποίος χορηγείται για την καταπολέμηση του άσθματος, το zileuton, δεν παρουσιάζει ευνοϊκές φαρμακοκινητικές ιδιότητες και προκαλεί ηπατοτοξικότητα. Επομένως, ο στόχος ήταν να ανακαλυφθούν νέες ενώσεις που στοχεύουν την 5-LOX, οι οποίες προσδένονται στο ένζυμο με τον ίδιο τρόπο με το zileuton. Ο σχεδιασμός νέων ενώσεων ξεκίνησε με μια έρευνα επανατοποθέτησης των φυσικών και τεχνητών γλυκαντικών ως προς τη δράση τους στην LOX, όπου αποδείχθηκε η ασπαρτάμη ως ένας ικανός LOX αναστολέας. Με στόχο της εξάλειψη των μεταβολιτών της ασπαρτάμης για τους οποίους υπάρχουν προβληματισμοί ως προς την ασφάλειά τους, σχεδιάστηκαν 12 ενώσεις με βάση τμήμα του δομικού σκελετού της ασπαρτάμης, οι οποίες εξετάστηκαν με in silico και in vitro μεθόδους. Τα αποτελέσματα υπέδειξαν ότι δύο απ’ αυτές τις ενώσεις εμφάνισαν αναταλτική δράση κατά της 5-LOX. Όσον αφορά το δεύτερο άξονα της διατριβής, το εμπορικά διαθέσιμο αντιϋπερτασικό φάρμακο, ιρβεσαρτάνη, μελετήθηκε με στόχο τη βελτίωση των φαρμακολογικών του ιδιοτήτων και την αποκάλυψη του μηχανισμού δράσης του. Η κύρια υπόθεση ως προς τον μηχανισμό δράσης προτείνει ότι το φάρμακο αρχικά εισέρχεται στη λιπιδική διπλοστοιβάδα και στη συνέχεια διαχέεται αργά προς τον διαμεμβρανικό υποδοχέα-στόχο, σε αντίθεση με την υπόθεση ότι το φάρμακο εισέρχεται απευθείας στον υποδοχέα. Επομένως, η ιρβεσαρτάνη εγκλείστηκε σε ένα μόριο-μεταφορέα 2-υδροξυπρόπυλο-β-κυκλοδεξτρίνης ώστε να βελτιωθούν οι φαρμακολογικές της ιδιότητες, ενώ μελετήθηκαν οι μοριακές της αλληλεπιδράσεις και η απελευθέρωσή της στη λιπιδική διπλοστοιβάδα με in silico και NMR μεθόδους. Τέλος, η έρευνα υπέδειξε ότι η ιρβεσαρτάνη απελευθερώνεται από τον μεταφορέα της και αποκαλύφθηκε η επικρατούσα διαμόρφωση του φαρμάκου στο εσωτερικό των λιπιδίων.