Νέες μεθόδοι ανάλυσης και ημισύνθεσης μη ψυχοτρόπων κανναβινοειδών και φαρμακολογική αξιολόγηση αυτών

Abstract

This PhD thesis focuses on the hemp Cannabis sativa L. (Cannabaceae) and non psycotropic cannabinoids. Initially, cultivars with high cannabidiol (CBD) and cannabigerol (CBG) content were cultivated in vitro. The consistency of the chemical profile of the acclimatized in vitro propagated clones was evaluated using quantitative 1H-NMR. In each cultivar, analysis of the micropropagated plant compared to the parent plant showed no statistically significant differences (p ≤ 0.05) in CBD + cannabidiolic acid (CBDA) and CBG + (cannabigerolic acid) CBGA content respectively, indicating the stability of their chemical profile.Then an extended 1H qNMR and a novel 2D-COSY qNMR method were developed for the rapid quantitation of different phytocannabinoids in extracts of hemp plants and hemp-based products. The 1H qNMR method was successfully used for the quantitative determination of CBD, CBDA, cannabinol (CBN), cannabichromene (CBC), cannabichromenic acid (CBCA), CBG, CBGA, δ9-tetrahydrocannabinol (δ9-THC), δ9-tetrahydrocannabinolic acid (δ9-THCA), δ8-tetrahydrocannabinol (δ8-THC), cannabielsoin (CBE) and cannabidivarin (CBDV). In addition, cannabidovarinic acid (CBDVA) and δ9-tetrahydrocannabivarinic acid (δ9-THCVA) could be distinguished from CBDA and δ9-THCA, respectively, while cannabigerovarin (CBGV) and δ8-tetrahydrocannabivarin (δ8-THCV) shared similar proton spectra with CBG and δ8-THC, respectively. The COSY qNMR method was applied for the quantitation of CBD, CBDA, CBN, CBG/CBGA and THC/THCA. Both methods were applied for the analysis of hemp plants and their extracts.Pilot-scale semi-synthesis of the cannabinoids CBN and CBG was carried out. An environmentally friendly approach for the total and large-scale synthesis of CBG and an improved method for the semi-synthesis of CBN, in a chemical reactor were developed. In addition, pharmacological investigation revealed that both CBG and CBN exhibit potent anti-seizure effects. Following induction of seizure activity in hippocampal mouse brain slices using the ex vivo high potassium model, decreased spontaneous activity in a dose-dependent manner was recorded. Their anticonvulsant effect was similar to the one of CBD, an FDA and EMA approved anti-epileptic drug. In addition, CBG and CBN were tested in several cancer cell lines, including MDA-MB-231, SKBR3, MCF10A, A2058 and SKMEL28. An initial screening showed slightly increased cytotoxicity of CBG against CBN. In parallel, the cytotoxic activity of the two cannabinoids in combination with each other and with CBD was evaluated. In addition, their safety profile was evaluated through acute oral toxicity experiments in mice, with per os doses up to 2000 mg/kg showing no toxicity.In the next chapter the study focused on CBC. In recent years, the enantiomeric ratio of CBC within the cannabis plant has attracted significant attention. CBC exists as a scalemic mixture, meaning it has two enantiomers: (S)-CBC and (R)-CBC, with the ratio between these enantiomers varying among different cannabis strains and even within individual plants. An accurate and robust chiral NMR method for analyzing CBC’s enantiomeric ratio, a well-investigated cannabinoid with numerous pharmacological targets, was developed. The use of Pirkle’s alcohol as the Chiral Solvating Agent (CSA), or, alternatively, the use of (S)-ibuprofen as a Chiral Derivatizing Agent (CDA) facilitated this analysis. A pharmacological examination was conducted for the (R) and (S)-CBC with respect to its most extensively studied pharmacological target, the transient receptor ankyrin 1 (TRPA1) channel. The two enantiomers showed the same strong agonistic effect as the racemic mixture. Finally, new semi-synthetic cannabinoids, the esters of cannabinoid acids, were synthesized. Initially, a method of simultaneous extraction and synthesis of cannabinoid acid esters was developed. The synthesis method was performed to produce esters of CBDA, CBGA and CBCA with C1-5 alcohols. Cannabinoid acid esters and their neutral forms (CBD, CBG and CBC) were evaluated for their effect on TRPA1 channels, which are implicated in several forms of cancer, and for their cytotoxicity. Trichomes of Cannabis sativa containing either CBDA or CBGA, were used for the synthesis of each ester. Cannabinoid esters showed a similar effect on TRPA1 activation, with their respective neutral cannabinoids in a single dose experiment. The in vitro study of the cytotoxic activity evaluated by the MTT assay showed that CBG and its respective esters were the most potent in MDA-MB-231 cancer cells. The butyl ester of CBGA (CBGA-But) also demonstrated a non-toxic profile in an oral in vivo acute toxicity assessment in mice.

Η παρούσα διδακτορική διατριβή σχετίζεται με το φυτό βιομηχανικής Cannabis sativa L. (Cannabaceae) και τα μη ψυχοτρόπα κανναβινοειδή. Αρχικά, αναπτύχθηκαν in vitro ποικιλίες βιομηχανικής Cannabis sativa L., με υψηλή περιεκτικότητα σε κανναβιδιόλη (CBD) και κανναβιγερόλη (CBG). Η σταθερότητα του χημικού προφίλ των εγκλιματισμένων in vitro πολλαπλασιασμένων κλώνων αξιολογήθηκε με τη χρήση ποσοτικού 1H-NMR που αναπτύχθηκε ειδικά για το συγκεκριμένη μελέτη. Σε κάθε ποικιλία, η ανάλυση του φυτού που μικροπολλαπλασιάστηκε σε σύγκριση με το μητρικό φυτό δεν έδειξε στατιστικά σημαντικές διαφορές (p ≤ 0,05) στην περιεκτικότητα σε CBD + κανναβιδιολικό οξύ (CBDA) και CBG + κανναβιγερολικό οξύ (CBGA) αντίστοιχα, υποδεικνύοντας έτσι τη σταθερότητα του χημικού τους προφίλ. Στη συνέχεια, αναπτύχθηκε μια διευρυμένη μέθοδος 1H qNMR και μια νέα μέθοδος 2D-COSY qNMR για τον ταχύ ποσοτικό προσδιορισμό 16 διαφορετικών φυτοκανναβινοειδών σε εκχυλίσματα φυτών βιομηχανικής κάνναβης και προϊόντων βασισμένων σε αυτή. Η μέθοδος 1H qNMR αναπτύχθηκε με επιτυχία για τον ποσοτικό προσδιορισμό των κανναβινοειδών CBD, CBDA, κανναβινόλη (CBN), της κανναβιχρωμένη (CBC), κανναβιχρωμενικό οξύ (CBCA), CBG, CBGA, δ9-τετραϋδροκανναβινόλη (δ9-THC), δ9-τετραϋδροκανναβινολικό οξύ (δ9-THCA), δ8-τετραϋδροκανναβινόλη (δ8-THC), κανναβιελσοΐνη (CBE) και κανναβιδιβαρίνη (CBDV). Επιπλέον, τα κανναβιδιβαρινικό οξύ (CBDVA) και δ9-τετραϋδροκανναβιβαρινικό οξύ (δ9-THCVA) μπόρεσαν να διακριθούν από το CBDA και το δ9-THCA αντίστοιχα, ενώ η κανναβιδιβαρίνη (CBGV) και η δ8-τετραϋδροκανναβιβαρίνη (δ8-THCV) παρουσίασαν παρόμοια φάσματα πρωτονίου με τη CBG και τη δ8-THC, αντίστοιχα. Η μέθοδος COSY qNMR εφαρμόστηκε για τον ποσοτικό προσδιορισμό των CBD, CBDA, CBN, CBG/CBGA και THC/THCA. Οι δύο μέθοδοι εφαρμόστηκαν για την ανάλυση φυτών βιομηχανικής κάνναβης και εκχυλισμάτων. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε ημισύνθεση σε πιλοτική κλίμακα των κανναβινοειδών κανναβινόλη (CBN) και κανναβιγερόλη (CBG). Πραγματοποιήθηκε μια νέα, φιλική προς το περιβάλλον προσέγγιση για την ολική και μεγάλης κλίμακας σύνθεση της CBG και μια βελτιωμένη μέθοδος για την ημισύνθεση της CBN, σε αντιδραστήρα 10 L. Παράλληλα πραγματοποιήθηκε φαρμακολογική έρευνα χρησιμοποιώντας το μοντέλο ex vivo υψηλής συγκέντρωσης καλίου, η οποία έδειξε ότι τόσο η CBG όσο και η CBN, μετά την επαγωγή επιληπτικής δραστηριότητας σε τομές του ιππόκαμπου σε εγκεφάλους ποντικιών, οδηγούν σε μειωμένη αυθόρμητη δραστηριότητα. Η αντιεπιληπτική τους δράση συγκρίθηκε με εκείνη της CBD, ενός εγκεκριμένου αντιεπιληπτικού φαρμάκου έναντι στα σύνδρομο Dravet και Lennox Gastaut. Επιπλέον, οι CBG και CBN δοκιμάστηκαν σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές, συμπεριλαμβανομένων των MDA-MB231, SKBR3, A2058 και SKMEL28. Ένας αρχικός έλεγχος έδειξε ελαφρώς αυξημένη κυτταροτοξικότητα της CBG έναντι της CBN. Στη συνέχεια, αξιολογήθηκε η κυτταροτοξική δράση των δύο κανναβινοειδών σε συνδυασμό μεταξύ τους και με τη CBD. Επιπλέον, το προφίλ ασφαλείας τους αξιολογήθηκε μέσω πειραμάτων οξείας τοξικότητας in vivo μετά από per os χορήγηση σε ποντίκια, σε δόσεις έως και 2000 mg/kg όπου δεν εμφάνισαν τοξικότητα. Στο επόμενο κεφάλαιο η μελέτη επικεντρώθηκε στο κανναβινοειδές κανναβιχρωμένη (CBC). Τα τελευταία χρόνια, η διακύμανση της αναλογίας των εναντιομερών της CBC στο φυτό της κάνναβης έχει προσελκύσει σημαντική προσοχή. Η CBC είναι ένα από τα πιο διαδομένα κανναβινοειδή που βρίσκονται στην κάνναβη, μαζί με τις THC και CBD. Η CBC υπάρχει ως σκαλεμικό μείγμα στη φυσική της κατάσταση, που σημαίνει ότι η αναλογία των δύο εναντιομερών, (S)-CBC και (R)-CBC, ποικίλλει μεταξύ διαφορετικών στελεχών κάνναβης, ακόμη και εντός μεμονωμένων φυτών. Αναπτύχθηκε μία εύκολη και γρήγορη μέθοδος χειρομορφικού NMR για την ανάλυση της εναντιομερικής αναλογίας της CBC, ενός πολύ μελετημένου κανναβινοειδούς με πολυάριθμους φαρμακολογικούς στόχους. Για την ανάλυση χρησιμοποιήθηκαν η αλκοόλη του Pirkle ως χειρόμορφος διαλυτικός παράγοντα (CSA) ή, εναλλακτικά, η (S)-ιβουπροφαίνη ως χειρόμορφος παράγοντας παραγωγογοποίησης (CDA). Στη συνέχεια, ακολούθησε φαρμακολογική εξέταση της (R)- και (S)-CBC, στα κανάλια TRP, παροδικού δυναμικού υποδοχέα αγκυρίνης 1 (TRPA1) ενός από τους κύριους στόχους του CBC με τα δύο εναντιομερή να εμφανίζουν την ίδια ισχυρή αγωνιστική δράση με το ρακεμικό μείγμα. Τέλος παράχθηκαν νέα ημισυνθετικά κανναβινοειδή, οι εστέρες των κανναβινοειδών οξέων. Οι ουσίες αυτές παράχθηκαν μέσω της ταυτόχρονης εκχύλισης και τροποποίησης των κανναβινοειδών οξέων. Η μέθοδος σύνθεσης πραγματοποιήθηκε για την παρασκευή εστέρων του CBDA, του CBGA και του CBCA. Οι εστέρες κανναβινοειδών οξέων και οι ουδέτερες μορφές τους (CBD, CBG και CBC) αξιολογήθηκαν ως προς την επίδρασή τους στα κανάλια TRPA1, τα οποία υπερεκφράζονται σε διάφορες μορφές καρκίνου, και ως προς την κυτταροτοξικότητά τους. Για τη σύνθεση κάθε εστέρα χρησιμοποιήθηκαν αδενώδη τριχίδια (trichomes) του φυτού βιομηχανικής Cannabis sativa που περιείχαν υψηλό ποσοστό είτε σε CBDA είτε σε CBGA. Οι κανναβινοειδείς εστέρες έδειξαν παρόμοια επίδραση στην ενεργοποίηση του TRPA1 με τα αντίστοιχα ουδέτερα κανναβινοειδή σε πείραμα μίας συγκέντρωσης. Η in vitro μελέτη της κυτταροτοξικής δράσης με τη δοκιμασία MTT έδειξε ότι η CBG και οι αντίστοιχοι εστέρες της ήταν οι πιο ισχυροί στα καρκινικά κύτταρα MDA-MB-231. Ο βουτυλεστέρας του CBGA (CBGA-But) παράλληλα έδειξε μη τοξικό προφίλ σε μια αξιολόγηση οξείας τοξικότητας in vivo σε ποντίκια με χορήγηση από το στόμα (per os).