Tinkering a distorted (α/β)7 barell: resurrection of the dead relative

Abstract

Polysaccharide deacetylases (PDAs) are enzymes belonging to the carbohydrate esterase family 4 (CE4). They act on various polysaccharides, including chitin, chitosans, peptidoglycans, and -1,6-GlcNAc polysaccharides. Members of the CE4 family share a NodB fold and function primarily as metal-dependent hydrolases targeting the cell wall peptidoglycan. Pathogenic bacteria like Bacillus anthracis have 11 distinct protein paralogues in this family and use N-deacetylation as molecular camouflage, making this a mechanism of great interest. Understanding structure-to-function relationships is crucial for comprehending the mechanism and the role of all these different paralogues. While investigating structures from members of this family, a unique hydroxylation event targeting the α-carbon of a proline residue was observed, and its relationship with the proposed mechanism of catalysis was explored. Reverse-engineering on a catalytically inert paralogue of this family was attempted to further elucidate the mechanism of catalysis and its relationship with the hydroxylation event, observed a few years earlier. The structure of Ba3943 and six mutants were determined by high-resolution X-ray crystallography. Three-dimensional superposition with an active homologue revealed significant differences in the catalytic center. Mutation of three key residues restored both hydroxylation and de-N-acetylation activities, further validating their relationship. Specifically, a well-conserved Arg residue near the active site emerged as a prerequisite for catalysis. In enzyme paralogues of this family, this Arg protruded from a different structural motif. This initial observation revealed an alternative, previously uncharacterized topology for the NodB domain, prompting the second part of this thesis, which involved a computational analysis coupled with an investigation of the existing literature on members of the CE4 family and other proteins that have adopted the NodB domain. In addition to a non-structured, flexible peptide of variable length preceding NodB, several members of the CE4 family contain additional domains whose functions or contributions to substrate specificity are not well characterized. Evidence suggests that CE4 family members consisting solely of the NodB domain have developed features linked to a variety of substrate specificities. To understand the NodB-based substrate diversity within the CE4 family, we conducted a comparative analysis of all structurally characterized NodB domains to date. Our analysis shows that variations in amino acid sequences, topological diversities, and deviations from the framework structure lead to different NodB domain classes, each associated with specific substrate specificities and functions both within and beyond the CE4 family. Our work reveals a link between specific NodB domain characteristics and substrate recognition, clarifying the details of the fold and associating its structural variations with function.

Οι απακετυλάσες πολυσακχαριτών (PDAs) είναι ένζυμα που ανήκουν στην οικογένεια εστερασών υδατανθράκων 4 (CE4). Δρουν σε διάφορους πολυσακχαρίτες, συμπεριλαμβανομένων της χιτίνης, των χιτοζανών, των πεπτιδογλυκανών και των 1,6-GlcNAc πολυσακχαριτών. Τα μέλη της οικογένειας CE4 μοιράζονται ένα μοτίβο NodB και λειτουργούν κυρίως ως υδρολάσες, εξαρτώμενες από μέταλλα, που στοχεύουν την πεπτιδογλυκάνη του κυτταρικού τοιχώματος. Παθογόνα βακτήρια όπως ο Bacillus anthracis έχουν 11 διακριτά παράλογα αυτής της οικογένειας και χρησιμοποιούν την απο-N-ακετυλίωση ως μοριακή παραλλαγή. Η κατανόηση της σχέσης δομής και λειτουργίας σε αυτή την οικογένεια είναι ζωτικής σημασίας για την κατανόηση του μηχανισμού. Κατά τη διερεύνηση δομών από μέλη αυτής της οικογένειας, παρατηρήθηκε μία ιδιαίτερη υδροξυλίωση που στοχεύει τον α-άνθρακα μίας προλίνης στο ενεργό κέντρο των ενζύμων. Μεταλλάσοντας ένα καταλυτικά ανενεργό παραλογό αυτής της οικογένειας, πίσω σε μία ενεργή κατάσταση, επιχειρήθηκε να διευκρινιστεί περαιτέρω ο μηχανισμός καταλύσεως και η σχέση του με την υδροξυλίωση της προλίνης. Η δομή της Ba3943 και έξι μεταλλαγμάτων της καθορίστηκε μέσω κρυσταλλογραφίας ακτίνων Χ υψηλής ανάλυσης. Η τρισδιάστατη υπέρθεση με έναν ενεργό ομόλογο αποκάλυψε σημαντικές τροποποίησεις στο καταλυτικό κέντρο. Η μετάλλαξη τριών βασικών αμινοξέων αποκατέστησε τόσο τις δραστηριότητες υδροξυλίωσης όσο και απο-N-ακετυλίωσης, επιβεβαιώνοντας περαιτέρω τη σχέση που έχουν αυτές οι δύο διαδικασίες. Πιο συγκεκριμένα, μία καλά διατηρημένη αργινίνη στην περιοχή του ενεργού κέντρου αναδείχθηκε ως προϋπόθεση για την καταλυτική του δράση. Στα παράλογα αυτής της οικογένειας ενζύμων η αργινίνη προερχόταν από ένα διαφορετικό δομικό μοτίβο. Αυτή η αρχική παρατήρηση αποκάλυψε μια εναλλακτική, προηγουμένως μη χαρακτηρισμένη τοπολογία για τον τομέα NodB και έγινε το εύναυσμα για το δεύτερο μέρος αυτής της διατριβής, το οποίο περιλάμβανε μια υπολογιστική ανάλυση σε συνδυασμό με μια ανασκόπηση της υπάρχουσας βιβλιογραφίας για τα μέλη της CE4 και άλλων πρωτεϊνών που έχουν υιοθετήσει τον τομέα NodB. Εκτός από ένα μη δομημένο, ευέλικτο πεπτίδιο μεταβλητού μήκους που προηγείται του NodB, πολλά μέλη της οικογένειας CE4 περιέχουν επιπλέον τομείς των οποίων οι λειτουργίες ή οι συνεισφορές στην εξειδίκευση υποστρώματος δεν έχουν καλά χαρακτηριστεί. Οι ενδείξεις υποδηλώνουν ότι τα μέλη της οικογένειας CE4 που αποτελούνται αποκλειστικά από τον τομέα NodB έχουν αναπτύξει χαρακτηριστικά συνδεδεμένα με μια ποικιλία εξειδικεύσεων υποστρώματος. Για να κατανοήσουμε την ποικιλομορφία των υποστρωμάτων που βασίζονται στον NodB εντός της οικογένειας CE4, διεξάγαμε μια συγκριτική ανάλυση όλων των δομικά χαρακτηρισμένων τομέων NodB μέχρι σήμερα. Η ανάλυσή μας δείχνει ότι οι διαφοροποιήσεις στις αλληλουχίες αμινοξέων, οι διαφορετικές τοπολογικές και οι αποκλίσεις από τη δομική βάση οδηγούν σε διαφορετικές κατηγορίες τομέων NodB, καθεμία συνδεδεμένη με συγκεκριμένες εξειδικεύσεις υποστρωμάτων και λειτουργίες τόσο εντός όσο και πέραν της οικογένειας CE4. Η εργασία μας αποκαλύπτει έναν σύνδεσμο μεταξύ των συγκεκριμένων χαρακτηριστικών του τομέα NodB και της αναγνώρισης υποστρώματος, διευκρινίζοντας τις λεπτομέρειες της αναδίπλωσης και συνδέοντας τις δομικές της παραλλαγές με τη λειτουργία.