Φλεγμονή και αναλγησία: ρόλος των νευροπεπτιδίων του στρές

Abstract

Inflammatory response is part of the innate immune response of the organism to factors that stimulate the immune system and cause stress, such as pathogenic microorganisms, chemicals, radiation or even trauma. Some of the symptoms of inflammation are: oedema, redness, local increase of the temperature and pain. One of the main factors that regulate the reaction of the organism to stressors is Corticotropin Releasing Hormone (CRH), a neuropeptide that was first found in ovine hypothalamus. CRΗ produced in the CNS (Central Nervous System) exerts indirect anti-inflammatory effects through the final product of the activation of the HPA axis, glucocorticoids from adrenal cortex. CRH is produced not only in regions of the CNS, but in several peripheral tissues and cells and tissues of the immune system as well. Locally expressed CRH shows pro-inflammatory effect. Central and local CRH exerts its anti-inflammatory and pro-inflammatory effects respectively, through the activation of two so far known receptors, CRF1 and CRF2 receptors. It's known that inflammatory diseases, including rheumatoid arthritis, are characterised by the sensation of chronic pain. Initially, the process of pain by the organism was attributed solely to mechanisms of the nervous system, but today there are many studies that show the production of molecules that induce analgesia (opioids) in peripheral inflamed tissues. Peripheral CRH induces the production of opioids from cells of the immune system, which in turn bind to their receptors on the terminals of sensory neurons and reduce the feeling of pain. Those studies involve mainly pharmacological experiments or experiments in which the gene of CRH was inactivated locally. The aim of the present study was to investigate the role of endogenous CRH in inflammatory pain. For this purpose, we used the CRH knockout (Crh-/-) mouse model in our experiments as well as their wild type littermates (Crh+/+). Crh-/- mice are characterized, among other characteristics, by very low basal levels of glucocorticoids in plasma. Mice of both genotypes were injected with CFA (Complete Freund's Adjuvant) in their left hind paw while their right hind paw remained untreated and served as control. To evaluate differences in pain thresholds we used the Plantar Test (Hargreaves Apparatus). Measurements were taken 3, 6 and 24 hours after CFA injection. Our results showed that Crh-/- mice had lower pain thresholds compared to Crh+/+ mice regarding to their inflamed paws. Paw oedema was estimated by a Plethysmometer. Crh-/- mice developed a more intense local paw oedema 3 hours after CFA injection which remained high up to 24 hours. In order to study further the CFA induced inflammation at cellular and molecular level, local inflamed paws were isolated 6 hours after CFA injection, a time point at which most differences in pain reaction and paw oedema were found. Histological evaluation showed a more intense inflammatory response in Crh-/- mice, as a higher leukocyte infiltration was observed in their inflamed paws compared to Crh+/+ mice. Furthermore, the levels of proinflammatory cytokines, IL-6, TNF-α and IL-1β were increased in inflamed paws of Crh-/- mice. These mice had also higher plasma IL-6 concentration than wild type mice. To clarify further the role of CRH and their receptors (CRF1 and CRF2) in the inflammatory pain model we used, we studied the expression of mRNA levels of these molecules in inflamed paws of both genotypes. CRH mRNA expression was not detected in inflamed paws of Crh-/- mice, as it was expected, but no expression was found in wild type mice either. Both receptors were expressed in inflamed paws of both genotypes, although Crh-/- mice showed a lower expression of CRF2 mRNA. No differences were found in CRF1 mRNA levels between the two genotypes. Concerning the induction of opioid synthesis in inflamed tissues, POMC mRNA levels were lower in paws from Crh-/- mice compared to Crh+/+ mice, 6 and 24 hours post CFA injection. To investigate the effect of glucocrticoid insufficiency of Crh-/- mice in the model of inflammatory pain we used, pain thresholds and paw oedema were estimated following glucocorticoid replacement of Crh-/- mice. Basal levels of glucocorticoids in Crh-/- mice were achieved by administration of corticosterone in their drinking water for four days before the induction of inflammation. No difference in pain thresholds and paw oedema were found between Crh-/- mice with corticosterone replacement and wild type mice. The results of the present study show for the first time the role of endogenous CRH in inflammatory pain. CRH deficiency resulted in decreased pain thresholds and at the same time in a more intense inflammatory reaction. Both outcomes confirm the anti-inflammatory role of CRH in CFA induced inflammation, partially mediated by the low levels of glucocorticoids in Crh-/- mice. Indeed, glucocorticoid administration improved significantly the status of Crh-/- mice regarding the inflammatory markers and the production of molecules that cause analgesia. Further studies are in progress which will try to explain the molecular mechanisms of CRH and glucocorticoids and the molecular pathways involved in inflammatory pain.

Η φλεγμονώδης αντίδραση είναι μία φυσική απάντηση του οργανισμού σε παράγοντες που προκαλούν διαταραχή του ανοσοποιητικού συστήματος καθώς επίσης και στρες όπως παθογόνοι μικροοργανισμοί, χημικές ουσίες, ακτινοβολίες ή ακόμη και τραυματισμός. Μερικά από τα συμπτώματα της φλεγμονής είναι τα εξής: οίδημα, ερύθημα, τοπική αύξηση της θερμοκρασίας και πόνος. Ένας από τους βασικούς παράγοντες που ρυθμίζουν την απόκριση του οργανισμού στα στρεσογόνα ερεθίσματα είναι η εκλυτική ορμόνη της κορτικοτροπίνης (CRH), ένα νευροπεπτίδιο που ανακαλύφθηκε για πρώτη φορά στον υποθάλαμο προβάτου. Η κεντρικά παραγόμενη CRH έχει αντι-φλεγμονώδη δράση η οποία διαμεσολαβείται από το τελικό προϊόν του υποθαλαμικού‐υποφυσιακού‐επινεφριδιακού (HPA) άξονα, τα γλυκοκορτικοειδή. Εκτός από το κεντρικό νευρικό σύστημα (ΚΝΣ), η CRH έχει ανιχνευθεί σε πληθώρα περιφερικών ιστών καθώς επίσης και στα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος. Η τοπικά παραγόμενη CRH σε καταστάσεις φλεγμονής δρα ως προ-φλεγμονώδης παράγοντας. Η CRH διαμεσολαβεί τόσο τις αντι-φλεγμονώδεις όσο και τις προ-φλεγμονώδεις δράσεις της μέσω δύο υποδοχέων, τον υποδοχέα 1 της CRH (CRF1) και τον υποδοχέα 2 της CRH (CRF2). Είναι γνωστό ότι πολλές φλεγμονώδεις ασθένειες συμπεριλαμβανομένης της ρευματοειδούς αρθρίτιδας, χαρακτηρίζονται από το αίσθημα έντονου χρόνιου πόνου. Αρχικά, η διαχείριση του πόνου από τον οργανισμό αποδόθηκε αποκλειστικά στους μηχανισμούς του νευρικού συστήματος, σήμερα όμως υπάρχουν πολλές μελέτες που υποδεικνύουν την παραγωγή μορίων (οπιοειδή) που επάγουν αναλγησία και από περιφερικούς ιστούς, σε καταστάσεις φλεγμονής. Η περιφερική CRH έχει βρεθεί πως μπορεί να επάγει την παραγωγή οπιοειδών μορίων από κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος, τα οποία με τη σειρά τους δρουν στους περιφερικούς αισθητικούς νευρώνες και μειώνουν την αίσθηση του πόνου. Οι μελέτες που αφορούσαν στο ρόλο της CRH στον πόνο περιλάμβαναν κυρίως φαρμακολογικές μελέτες ή μελέτες στις οποίες είχε γίνει απενεργοποίηση του γονιδίου της CRH τοπικά. Στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνηθεί ο ρόλος της ενδογενούς CRH στον φλεγμονώδη πόνο. Για τον σκοπό αυτό, στα πειράματά μας χρησιμοποιήθηκε το μοντέλο μυών με γενετική έλλειψη της CRH (Crh-/- μύες), καθώς και μύες αγρίου τύπου (Crh+/+ μύες). Οι Crh-/- μύες χαρακτηρίζονται επιπλέον από χαμηλά επίπεδα γλυκοκορτικοειδών στο πλάσμα. Στους μυς και των δύο γονότυπων χορηγήθηκε CFA (Complete Freund's Adjuvant) στο πίσω δεξί πέλμα, ενώ το αριστερό πέλμα αποτελούσε το πέλμα ελέγχου. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκαν μετρήσεις οδού πόνου σε 3, 6 και 24 ώρες μετά τη χορήγηση του CFA με τη μέθοδο Plantar Test (συσκευή Hargreaves Apparatus). Τα αποτελέσματά μας έδειξαν πως οι Crh-/- μύες εμφάνισαν χαμηλότερα επίπεδα ουδού πόνου σε σχέση με τους Crh+/+ μύς σε ό,τι αφορά στο φλεγμαίνον πέλμα. Η εκτίμηση του οιδήματος έγινε με τη βοήθεια του πληθυσμόμετρου. Οι Crh-/- μύες χαρακτηρίζονταν από τοπικό οίδημα μεγαλύτερου μεγέθους ήδη από τις 3 ώρες μετά την επαγωγή της φλεγμονής, το οποίο παρέμενε υψηλό ακόμη και 24 ώρες μετά. Προκειμένου να διερευνηθεί περαιτέρω η επαγόμενη από CFA φλεγμονώδης αντίδραση σε κυτταρικό και μοριακό επίπεδο, ελήφθησαν οι τοπικοί φλεγμαίνοντες ιστοί 6 ώρες μετά τη χορήγηση του CFA, χρονικό διάστημα που παρατηρήθηκαν οι μεγαλύτερες διαφορές στην αντίδραση στον πόνο και στον όγκο του οιδήματος ανάμεσα στους δύο γονότυπους. Ιστολογικές μελέτες έδειξαν μεγαλύτερη ανοσολογική αντίδραση στους Crh-/- μυς σε σχέση με τους Crh+/+ καθώς, παρατηρήθηκε μεγαλύτερη συγκέντρωση λευκοκυττάρων στους πρώτους. Παράλληλα, τα επίπεδα των προφλεγμονώδων κυτοκινών (IL-6, TNF-α και IL-1β) στους τοπικούς φλεγμαίνοντες ιστούς ήταν υψηλότερα στους Crh-/- μύς σε σχέση με τους Crh+/+. Η συγκέντρωση της IL-6 ήταν επίσης υψηλότερη στο πλάσμα των Crh-/- μυών 6 ώρες μετά τη χορήγηση του CFA σε σχέση με τους Crh+/+ μυς. Για να αποσαφηνιστεί περισσότερο ο ρόλος της CRH και των υποδοχέων της (CRF1και CRF2) στο μοντέλο φλεγμονώδους πόνου που χρησιμοποιήσαμε, μελετήθηκε η έκφραση του mRNA των παραπάνω μορίων στους τοπικούς φλεγμαίνοντες ιστούς. Όπως αναμενόταν, δεν παρατηρήθηκε έκφραση του mRNA της CRH στους Crh-/- μυς, αλλά ούτε και στους μυς αγρίου τύπου. Οι υποδοχείς ανιχνεύτηκαν και στους δύο γονότυπους, με τα επίπεδα του mRNA του CRF2 να είναι πολύ χαμηλότερα στους Crh-/- μυς σε σχέση με τους Crh+/+ μυς. Τα επίπεδα του mRNA του CRF1 δεν διάφεραν στατιστικώς σημαντικά μεταξύ των δύο γονότυπων. Σε ό,τι αφορά την επαγωγή οπιοειδών μορίων στους τοπικούς φλεγμαίνοντες ιστούς, βρέθηκε πως οι Crh-/- μύες είχαν μειωμένα επίπεδα του mRNA της POMC σε σχέση με τους μυς αγρίου τύπου 6 και 24 ώρες μετά τη χορήγηση του CFA. Οι Crh-/- μύες χαρακτηρίζονται, εκτός από τη γενετική έλλειψη της ενδογενούς CRH,και από χαμηλά επίπεδα γλυκοκορτικοειδών στο πλάσμα. Προκειμένου να διερευνηθεί αν τα αποτελέσματά μας οφείλονται στη γενετική έλλειψη της CRH ή στην ανεπάρκεια γλυκοκορτικοειδών, μελετήσαμε τόσο την αντίδραση στον πόνο αλλά και τη φλεγμονώδη αντίδραση σε μύες στους οποίους έγινε αποκατάσταση των επιπέδων των γλυκοκορτικοειδών στα φυσιολογικά με τη χορήγηση εξωγενώς γλυκοκορτικοειδών. Τα αποτελέσματα στους Crh-/- μύες με αποκατάσταση των γλυκοκορτικοειδών δεν είχαν διαφορές με αυτά των μυών αγρίου τύπου. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης δείχνουν για πρώτη φορά το ρόλο της ενδογενούς CRH στο φλεγμονώδη πόνο. Η απουσία της CRH οδήγησε σε αυξημένα επίπεδα πόνου και ταυτόχρονα σε εντονότερη φλεγμονώδη αντίδραση, γεγονός που επιβεβαιώνει τον αντιφλεγμονώδη ρόλο της CRH στην επαγόμενη από CFA φλεγμονή διαμεσολαβούμενο, εν μέρει, από τα χαμηλά επίπεδα γλυκοκορτικοειδών. Πράγματι η χορήγηση γλυκοκορτικοειδών βελτίωσε κατά πολύ την εικόνα των Crh-/- μυών σε σχέση με τους παράγοντες φλεγμονής και την παραγωγή μορίων που επάγουν αναλγησία. Επιπλέον μελέτες βρίσκονται σε εξέλιξη για να διαπιστωθεί ο μοριακός μηχανισμός δράσης της CRH και των γλυκοκορτικοειδών και των μεσολαβούμενων μοριακών μονοπατιών στο φλεμονώδη πόνο.