Σχεδιασμός χιμαιρικών ενζύμων για την ανάπτυξη περιοριστικών ενδονουκλεασών με νέες καταλυτικές ιδιότητες: διερεύνηση του βιοχημικού και δομικού πλαισίου της προσέγγισης

Abstract

Type II restriction enzymes are the modern 'scissors' of molecular biology with various applications in biomedical research, biotechnology and diagnostics. Extensive studies in the second half of the last century have focused on their biochemistry and their structural biology regarding the mechanisms of catalysis, oligomerization, as well as specific recognition of their target sequences, on the basis of which they are judged as enzymes of exceptional specificity. Among them, the restriction enzyme EcoRV is one of the most well-studied proteins, and PvuII, one of the smallest type II restriction endonucleases, has been the subject of numerous structural studies. Although lacking significant homology in their primary sequence, these two enzymes exhibit remarkable structural similarity. This was the driving force for the creation of an artificial fusion protein, designed to perform a new specialized endonucleolytic digestion reaction, within the framework of engineering innovative enzymes. Τhe single chain protein PvuII-EcoRV incorporates the genetically engineered protein domains of the restriction enzymes EcoRV and PvuII and it was the subject of my PhD Thesis. The PvuII-EcoRV single-chain protein was designed via a rational design that exploits the dimerization of the dimerization subdomain of PvuII, in order to produce the hybrid activity. The initial aim was the expression of the protein in a soluble form, since restriction enzymes normally exhibit their biological activity in solution. Subsequently, in the context of biochemical characterization, we performed efforts for the protein isolation, in order to use it for digestion assays, with plasmid and oligo DNA as a substrate, binding assays, with oligo DNA and kinetic studies. The observed activity of the quite active chimeric protein, as well as the non-specific and extensive DNA fragmentation observed in the digestion assays, prompted us to investigate the communication mechanism between specific DNA recognition and catalysis in the general context of investigating the type II restriction endonucleases. A critical amino acid found to be part of a magnesium-binding site and predicted to be involved in the transmission of specific recognition information in the PvuII active site, tyrosine 94, was studied in terms of biochemical and kinetic behavior of a PvuII single chain variant. Finally, after comparing crystallographic structures of type II restriction enzymes, we investigated the topological homology with the Y94 of PvuII, for various hydrophilic amino acids in other nucleases, including BglI, BglII, BamHI.

Τα περιοριστικά ένζυμα τύπου ΙΙ αποτελούν τα σύγχρονα «ψαλίδια» της μοριακής βιολογίας με πληθώρα εφαρμογών στη βιοϊατρική έρευνα, τη βιοτεχνολογία και τη διάγνωση. Εκτενείς μελέτες στα τέλη του προηγούμενου αιώνα έχουν εστιάσει στη βιοχημεία και τη δομική τους βιολογία αναφορικά με τους μηχανισμούς κατάλυσης, ολιγομερισμού, καθώς και ειδικής αναγνώρισης των αλληλουχιών-στόχων τους, βάσει της οποίας κρίνονται ως ένζυμα εξαιρετικής εξειδίκευσης. Μεταξύ αυτών, το περιοριστικό ένζυμο EcoRV είναι μια από τις πιο καλά μελετημένες πρωτεΐνες, ενώ ενδιαφέρον παρουσιάζει μια από τις πιο μικρές ενδονουκλεάσες περιορισμού τύπου ΙΙ, η PvuII. Tα δυο αυτά ένζυμα, μολονότι στερούνται ιδιαίτερης ομολογίας στην πρωτοταγή τους αλληλουχία, παρουσιάζουν αξιοσημείωτη δομική ομοιότητα. Το γεγονός αυτό αποτέλεσε τον κινητήριο μοχλό για τη δημιουργία μιας τεχνητής πρωτεΐνης σύντηξης, σχεδιασμένης να επιτελεί μια καινούργια εξειδικευμένη αντίδραση ενδονουκλεολυτικής πέψης, στα πλαίσια της γενικότερης προσέγγισης για ανακάλυψη καινοτομικών ενζύμων. Πρόκειται για την πρωτεΐνη μονής αλυσίδας (single chain) PvuII-EcoRV, η οποία ενσωματώνει τις γενετικά τροποποιημένες πρωτεϊνικές επικράτειες των δυο εν λόγω ενζύμων και αποτέλεσε το αντικείμενο μελέτης της Διδακτορικής μου Διατριβής. Η πρωτεΐνη μονής αλυσίδας PvuII-EcoRV σχεδιάστηκε με λογικό σχεδιασμό που αξιοποιεί το διμερισμό της υποεπικράτειας διμερισμού της PvuII, προκειμένου να επιτευχθεί η υβριδική δραστικότητα PvuII-EcoRV. Αρχικός στόχος ήταν η έκφρασή της σε διαλυτή μορφή, μιας και έτσι εκδηλώνουν τα περιοριστικά ένζυμα τη βιολογική τους δράση. Εν συνεχεία, στα πλαίσια βιοχημικού χαρακτηρισμού, έγιναν προσπάθειες απομόνωσης της πρωτεΐνης, με απώτερο στόχο την αξιοποίηση της σε δοκιμές πέψης με υπόστρωμα πλασμιδιακό και ολιγονουκλεοτιδικό DNA, δοκιμές πρόσδεσης με ολιγονουκλεοτιδικό DNA και κινητικές μελέτες. Η παρατηρούμενη δραστικότητα της αρκετά ενεργής χιμαιρικής πρωτεΐνης, καθώς και ο μη ειδικός και εκτεταμένος κατακερματισμός του DNA που παρατηρήθηκε στις δοκιμές πέψης, μας ώθησε στο να εστιάσουμε στον μηχανισμό επικοινωνίας μεταξύ ειδικής αναγνώρισης του DNA και κατάλυσης στα γενικότερα πλαίσια έρευνας των περιοριστικών ενδονουκλεασών τύπου ΙΙ. Ένα κρίσιμο αμινοξύ που έχει βρεθεί ότι αποτελεί μέρος μιας θέσης δέσμευσης μαγνησίου και εικάζεται ότι συμμετέχει στη διαβίβαση της πληροφορίας ειδικής αναγνώρισης στο ενεργό κέντρο της PvuII, η τυροσίνη 94, μελετήθηκε ως προς τη βιοχημική και κινητική συμπεριφορά μιας παραλλαγής της PvuII μονής αλυσίδας. Τέλος, κατόπιν σύγκρισης κρυσταλλογραφικών δομών των περιοριστικών ενζύμων τύπου ΙΙ, διερευνήσαμε την τοπολογική ομολογία με την Y94 της PvuII, διάφορων υδρόφιλων αμινοξέων σε άλλες νουκλεάσες, μεταξύ των οποίων οι BglI, BglII, BamHI.