Strain engineering and cultivation optimization of the yeast Yarrowia lipolytica for biotechnological processes

Abstract

Yarrowia lipolytica (Y. lipolytica) is an oleaginous and aerobic yeast, known for its ability to accumulate and store intracellular lipids, which can serve as potential feedstock for second-generation biodiesel production. Hitherto, strain and process engineering approaches have been employed to enhance lipid production and optimize the utilization of crude glycerol, a low-cost by-product of the biodiesel industry that is efficiently catabolized from the yeast. Despite substantial research on that topic, further improvements in white biotechnology are necessary to attain the desirable efficiency and sustainability. The aim of this thesis, is to contribute to a better understanding of the fermentation of Y. lipolytica in crude glycerol and its potential for SCO production. To achieve that, special emphasis is given on novel strain and process engineering techniques, to generate novel robust strains and optimize lipid extraction and fermentation processes, respectively. The review of the relevant literature sheds light on (i) the metabolic mechanisms involved in the bioconversion of glycerol to lipids, (ii) the scale-up challenges of the lipid extraction (downstream) process and (iii) the influence of critical fermentation parameters and operating modes on cell growth and lipid synthesis. Therefore, the work reported herein is divided in three parts, aiming to improve biomass and SCO production from a Y. lipolytica fermentation process. The first part is focused on applying adaptive laboratory evolution (ALE) to generate novel evolved strains with increased tolerance to high glycerol concentrations. Differential gene expression analysis of the evolved isolates, which demonstrated enhanced growth and lipid content, revealed the activated evolutionary mechanisms responsible for the enhanced phenotype. In the second part, laboratory optimization of an industrially applicable lipid extraction process is pursued, resulting in an optimum variable combination that is successfully reproduced in a 50-times larger scale. In the third part, a systematic assessment of bioreactor fermentations under different process parameters and operating modes is conducted. This approach aims to gather adequate fermentation process data, allowing to develop a reliable simulation model and integrate the membrane bioreactor technology (MBR) in Y. lipolytica fermentations. The developed model can satisfactorily predict the fermentation kinetics of a batch, a semi-continuous, a fed-batch MBR and a continuous MBR process. The successfully tested MBR system can shift the dynamics of the yeast’s metabolism in a positive way (under specific operating modes), which is promising for future research and the establishment of MBR technology for Y. lipolytica fermentations.

Η ζύμη Yarrowia lipolytica (Y. lipolytica) είναι μία αυστηρώς αερόβια και ελαιογόνος ζύμη, γνωστή για την ικανότητα της να συσσωρεύει ενδοκυτταρικά λιπίδια, τα οποία μπορούν να αξιοποιηθούν ως πρώτη ύλη για βιοντίζελ δεύτερης γενιάς. H ενίσχυση της βιοσύνθεσης των λιπιδίων έχει μελετηθεί διεξοδικά εφαρμόζοντας τεχνολογίες γενετικής μηχανικής και διεργασιών, και εντάσσοντας ως υπόστρωμα την ακατέργαστη γλυκερόλη, μία φθηνή πηγή άνθρακα που αποτελεί παραπροϊόν της παραγωγής βιοντίζελ. Ωστόσο, η παραγωγή των λιπιδίων σε μεγάλη κλίμακα απαιτεί περαιτέρω μελέτη για να καταστεί οικονομικά βιώσιμη. Ο στόχος αυτής της διατριβής είναι να συμβάλει στην καλύτερη κατανόηση της καλλιέργειας της Y. lipolytica σε υπόστρωμα ακατέργαστης γλυκερόλης, και στην ανάπτυξη της διεργασίας παραγωγής λιπιδίων. Ιδιαίτερη έμφαση δίνεται σε τεχνολογίες γενετικής μηχανικής για την ανάπτυξη νέων βελτιωμένων στελεχών και σε μεθόδους βελτιστοποίησης διεργασιών τόσο για την διεργασία εκχύλισης των λιπιδίων όσο και για τη διεργασία ζύμωσης. Η ανασκόπηση της σχετικής βιβλιογραφίας αναδεικνύει (i) τους μεταβολικούς μηχανισμούς που εμπλέκονται στη βιο-μετατροπή της γλυκερόλης σε λιπίδια, (ii) τις προκλήσεις της κλιμάκωσης μεγέθους της εκχύλισης λιπιδίων και (iii) την επίδραση κρίσιμων παραμέτρων ζύμωσης και μεθόδων λειτουργίας του βιοαντιδραστήρα στην κυτταρική ανάπτυξη και τη λιπογένεση. Με βάση τα παραπάνω, η παρούσα διατριβή υποδιαιρείται σε τρία μέρη, με γενικό στόχο την αύξηση της παραγωγής της βιομάζας και των λιπιδίων. Το πρώτο μέρος επικεντρώνεται στη δημιουργία νέων εξελιγμένων στελεχών με ανθεκτικότητα σε υψηλές συγκεντρώσεις γλυκερόλης. Η ανάλυση της διαφορικής γονιδιακής έκφρασης των πιο βελτιωμένων στελεχών αποκαλύπτει τους μηχανισμούς προσαρμογής που οδηγούν στο βελτιωμένο φαινότυπο κάθε στελέχους. Το δεύτερο μέρος αποτελείται από τη βελτιστοποίηση της εκχύλισης λιπιδίων σε εργαστηριακή κλίμακα, με αποτέλεσμα έναν βέλτιστο και βιομηχανικά εφαρμόσιμο συνδυασμό παραμέτρων που αναπαράγεται επιτυχώς σε 50-φορές μεγαλύτερη κλίμακα. Στο τρίτο μέρος, μελετάται η διεργασία ζύμωσης σε εργαστηριακό βιοαντιδραστήρα, επιδιώκοντας την ανάπτυξη ενός μαθηματικού μοντέλου προσομοίωσης και την ανάπτυξη της διεργασίας σε βιοαντιδραστήρα μεμβρανών (MBR). Το μαθηματικό μοντέλο μπορεί να προβλέψει ικανοποιητικά την κινητική της ζύμωσης σε διάφορες συνθήκες λειτουργίας του βιοαντιδραστήρα, ενώ η επιτυχής ενσωμάτωση του MBR στη διεργασία, επηρέασε θετικά την κινητική της ζύμωσης (σε συγκεκριμένες συνθήκες λειτουργίας). Τα αποτελέσματα της διατριβής είναι ενθαρρυντικά για την ανάπτυξης της τεχνολογίας MBR στις ζυμώσεις της ζύμης Y. lipolytica.