In vitro effects of new synthetic and natural compounds on mouse and human neural stem cells and adult neurogenesis in Alzheimer's disease

Abstract

Neurogenesis in the adult mammalian brain decreases significantly after birth, but key neurogenic niches persist in the cortex and hippocampus in different mammals, including human. Importantly, impaired adult neurogenesis has been linked to Alzheimer’s Disease (AD) pathology, providing a promising new avenue for therapeutic intervention. However, there are important technical challenges in the use of in-vivo models to conduct screens for novel neurogenic drugs, such as the scarcity of neural stem cells (NSCs) in the adult brain, variability between mouse and human models or ethical considerations. In the present PhD thesis, a combination of complementary mouse and human stem cell models were used for in vitro screening and characterization of novel neurogenic compounds, aiming to overcome some of these limitations. Following up on previous work, this drug testing effort focused on brain-derived neurotrophic factor (BDNF), as a crucial neurotrophin regulating neuronal growth and differentiation via its receptor tyrosine receptor kinase B (TrkB). First, an extensive screen of three small molecule libraries from the EuroNeurotrophin consortium is described, assessing compound ability to prevent cell death and promote proliferation via the BDNF/TrkB pathway. Promising candidates were additionally screened using mouse primary adult hippocampal NSCs and embryonic cortical NSCs, investigating if compounds can counter Amyloid-β (Aβ) induced cell death, in the absence of EGF/FGF and promote proliferation, acting specifically through TrkB activation. Selected candidates were also tested for their ability to increase astrocytic gene markers involved in NSC maintenance, protect hippocampal neurons from Αβ toxicity and prevent synapse loss after Aβ treatment. To provide a translational link to human cells, neural progenitor cells (NPCs) differentiated from three human induced pluripotent stem cell (iPSC) lines from healthy and AD donors were also used for further characterization of two top priority candidates. These experiments supported that compounds ENT-A011 and ENT-A061 successfully induced proliferation and prevented cell death after Aβ toxicity of human NPCs. Finally, focusing on ENT-A011, RNA-seq profiling was used to show that the compound acts through a core gene network shared with BDNF, highlighting key aspects of how compound action is mediated in human NPCs. Overall, this work provides a set of new promising synthetic and natural BDNF mimetics with potential neurogenic and neuroprotective actions in AD, including high priority candidates with demonstrated translational interest for downstream testing. Using dedicated stem cell-based screening, this project strived to promote the reuse, reduction and refinement of animal use, demonstrating the promise of stem cell systems for short-listing competitive therapeutic candidates.

Η νευρογένεση στον εγκέφαλο των ενήλικων θηλαστικών μειώνεται σημαντικά μετά τη γέννηση, αλλά βασικές νευρογενετικές εστίες παραμένουν στον φλοιό και τον ιππόκαμπο σε διάφορα θηλαστικά, συμπεριλαμβανομένου του ανθρώπου. Είναι σημαντικό ότι η εξασθενημένη νευρογένεση στους ενήλικες έχει συνδεθεί με την παθολογία της Νόσου Αλτσχάιμερ (AD), παρέχοντας μια πολλά υποσχόμενη νέα οδό για θεραπευτική παρέμβαση. Ωστόσο, υπάρχουν σημαντικές τεχνικές προκλήσεις στη χρήση μοντέλων in-vivo για την αναγνώριση νέων νευρογενετικών ουσιών, όπως η σπανιότητα των νευρικών βλαστοκυττάρων (NSCs) στον εγκέφαλο των ενηλίκων, οι διαφορές μεταξύ μοντέλων ποντικού και ανθρώπου ή οι ηθικές επιπτώσεις. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, χρησιμοποιήθηκε ένας συνδυασμός συμπληρωματικών μοντέλων βλαστοκυττάρων ποντικού και ανθρώπου για την in vitro αναγνώριση και τον χαρακτηρισμό νέων νευρογενετικών ουσιών, με στόχο την υπέρβαση ορισμένων από τους προηγούμενους περιορισμούς. Βασιζόμενοι σε προηγούμενες εργασίες, αυτή η προσπάθεια δοκιμής φαρμάκων επικεντρώθηκε στον brain-derived neurotrophic factor (BDNF), ως ένα κρίσιμο νευροτροφικό παράγοντα που ρυθμίζει την ανάπτυξη και τη διαφοροποίηση των νευρώνων μέσω του υποδοχέα του, tyrosine receptor kinase B (TrkB). Αρχικά, περιγράφεται μια εκτενής διερεύνηση τριών βιβλιοθηκών μικρών μορίων από τη συνεργασία EuroNeurotrophin, αξιολογώντας την ικανότητα των ουσιών να αποτρέψουν τον κυτταρικό θάνατο και να προάγουν τον πολλαπλασιασμό μέσω του μονοπατιού BDNF/TrkB. Τα πιο υποσχόμενα μόρια εξετάστηκαν επιπλέον χρησιμοποιώντας ενήλικα πρωτογενή νευρικά βλαστοκύτταρα ιππόκαμπου ποντικού και εμβρυονικά βλαστοκύτταρα φλοιού, ερευνώντας αν οι ουσίες μπορούν να αντιμετωπίσουν τον κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από το Αμυλοειδές-β (Aβ), απουσία EGF/FGF και να προάγουν τον πολλαπλασιασμό, ενεργώντας συγκεκριμένα μέσω της ενεργοποίησης του TrkB. Επιλεγμένοι υποψήφιοι δοκιμάστηκαν επίσης για την ικανότητά τους να αυξήσουν τους αστροκυτταρικούς γονιδιακούς δείκτες που εμπλέκονται στη διατήρηση των NSCs, να προστατεύσουν τους νευρώνες του ιππόκαμπου από την τοξικότητα του Αβ και να αποτρέψουν την απώλεια συνάψεων μετά τη έκθεση σε Αβ. Στοχεύοντας στη μετάφραση αυτής της διερεύνησης σε ανθρώπινα κύτταρα, χρησιμοποιήθηκαν νευρικά προγονικά κύτταρα (NPCs) διαφοροποιημένα από τρεις ανθρώπινες επαγόμενες πολυδύναμες βλαστοκυτταρικές σειρές από υγιείς παρόχους και ασθενείς με AD, για τον περαιτέρω χαρακτηρισμό δύο υποψήφιων μορίων υψηλής προτεραιότητας. Αυτά τα πειράματα υποστήριξαν ότι τα μόρια ENT-A011 και ENT-A061 προήγαγαν επιτυχώς τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και απέτρεψαν τον κυτταρικό θάνατο μετά από τοξικότητα με Αβ σε ανθρώπινα NPCs. Τέλος, εστιάζοντας στο ENT-A011, χρησιμοποιήθηκε ανάλυση RNA-seq για να δειχθεί ότι η ουσία δρα μέσω ενός βασικού γονιδιακού δικτύου που είναι κοινό με τον BDNF, υπογραμμίζοντας βασικές πτυχές του τρόπου με τον οποίο διαμεσολαβείται η δράση της ουσίας στα ανθρώπινα NPCs. Συνολικά, αυτή η εργασία παρέχει ένα σύνολο νέων πολλά υποσχόμενων συνθετικών και φυσικών μιμητικών μορίων του BDNF, με πιθανές νευρογενετικές και νευροπροστατευτικές δράσεις στη νόσο του Αλτσχάιμερ, συμπεριλαμβανομένων υποψηφίων υψηλής προτεραιότητας με αποδεδειγμένο μεταφραστικό ενδιαφέρον για περαιτέρω δοκιμές. Χρησιμοποιώντας εξειδικευμένα in vitro διερεύνηση βασισμένη σε βλαστοκύτταρα, αυτή η εργασία στοχεύει στο να προάγει την επαναχρησιμοποίηση, τη μείωση και τη βελτίωση της χρήσης μοντέλων ζώων, προωθώντας τη χρήση συστημάτων βλαστοκυττάρων για τη γρήγορη αναγνώριση ανταγωνιστικών θεραπευτικών υποψηφίων.