Ανακάλυψη νέων φαρμακολογικών στόχων για την Πλάγια Αμυοτροφική Σκλήρυνση (ALS)

Abstract

Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is a rare degenerative disease of the motor neurons, affecting about 2 in every 100,000 people. It is mainly characterized by cramps and muscle weakness in the upper and/or lower limbs, leading to paralysis and usually premature death within an average of 3 to 5 years from symptom onset. There are two types of ALS: sporadic, which occurs randomly without any family history, and familial, which is inherited. The causes of the disease are not fully understood, but genetic and environmental factors play a role. More than 30 genes have been found to cause familial ALS, leading to protein deposits consisting of different proteins such as SOD1, TDP-43, and FUS. The aim of this thesis was to investigate the role of proteolysis, likely controlled by KLK6, and the role of NRF2, the main transcription factor associated with antioxidant action, in ALS. Initially, the study showed that it is necessary to distinguish the patients with ALS based on their genetic profile for an effective pharmacotherapeutic approach in a chemogenomic-like way. The study then focused on the SOD1-ALS category, which is characterized by increased oxidative stress, and tested the efficacy of administering Dimethyl Fumarate (DMF) to Tg-SOD1G93A mice. DMF is an approved drug for psoriasis and relapsing remitting multiple sclerosis that is considered to activate the NRF2. The results showed that female mice showed slight improvement in symptoms and a delayed onset of the disease, without an increase in the survival time. The study also demonstrated that KLK6 could proteolyze monomeric SOD1 and SOD1G93A derived from the lumbar spinal cord protein extract. Additionally, it was found that female Tg-SOD1G93AKlk6+/- mice presented milder symptoms compared to female mice with Tg-SOD1G93A genotype. Finally, it was found that DMF administration to Tg-SOD1G93A mice increased Klk6 expression levels, while SH-SY5Y cell stimulation with KLK6 activated the NRF2 pathway, possibly indicating a relationship between NRF2 and KLK6. These results suggest that DMF could be used to treat ALS patients characterized by mutations in the SOD1 gene, especially in female individuals. In addition, KLK6 may be involved in the progression of SOD1-related disease through multiple mechanisms involving activation of the Nrf2 pathway and proteolysis of SOD1. Notably, deletion of one Klk6 allele in Tg-SOD1G93A mice resulted in only slight improvement in phenotype, particularly in female mice, indicating the involvement of extra unknown pathways dependent on KLK6 in SOD1-ALS. Finally, the study showed that the SOD1G93A protein could be immobilized in calcium pyrophosphate particles and thus used as an antigen in future vaccinations to treat SOD1-ALS patients.

Η πλάγια αμυοτροφική σκλήρυνση (Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS) είναι μια σπάνια (2:100,000) νόσος του κινητικού νευρώνα που εμφανίζεται κυρίως με κράμπες και μυϊκή αδυναμία στα άνω ή/και κάτω άκρα και οδηγεί σε παράλυση και συνήθως σε πρόωρο θάνατο (κατά μέσο όρο μέσα σε 3 - 5 χρόνια από την έναρξη των συμπτωμάτων). Υπάρχουν δύο διαφορετικοί τύποι ALS η σποραδική, με τυχαία εμφάνιση χωρίς να υπάρχει κάποιο οικογενειακό ιστορικό και εμφανίζεται σε μεγαλύτερο ποσοστό ασθενών, καθώς και εκείνη που κληρονομείται από κάποιο γονέα. Τα αίτια εμφάνισης της νόσου δεν είναι πλήρως κατανοητά. Παρ’ ολ αυτά φαίνεται να παίζουν ρόλο τόσο οι γενετικοί όσο και οι περιβαλλοντικοί παράγοντες. Έχουν βρεθεί περισσότερα από 30 γονίδια των οποίων μεταλλάξεις οδηγούν σε οικογενή μορφή ALS ενώ χαρακτηρίζονται από αποθέσεις διαφορετικών πρωτεϊνών π.χ. συσσωματώματα SOD1, TDP-43, FUS.Ο σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν να διερευνηθεί ο ρόλος της πρωτεόλυσης που πιθανότατα ελέγχεται από την KLK6 καθώς και ο ρόλος του Nrf2 του κύριου μεταγραφικού παράγοντα που συνδέεται με αντιοξειδωτική δράση στην ALS. Αρχικά δείχθηκε ότι είναι αναγκαίο να διακρίνονται οι ασθενείς που πάσχουν με ALS με βάση το γενετικό τους προφίλ για τη φαρμακοθεραπεία μέσω μιας χημειογονιδιωματικής προσέγγισης. Στη συνέχεια επιλέχθηκε η κατηγορία SOD1-ALS που χαρακτηρίζεται από αύξηση του οξειδωτικού στρες για μελέτη και χορηγήθηκε φουμαρικός διμεθυλεστέρας (DMF, Dimethyl Fumarate) σε μύες Tg-SOD1G93A. Δείχθηκε ότι οι θηλυκοί μύες παρουσίασαν μικρή βελτίωση των συμπτωμάτων χωρίς όμως αύξηση του χρόνου επιβίωσης.. Επίσης δείχθηκε ότι η KLK6 μπορεί να πρωτεολύσει μονομερή της SOD1 καθώς και SOD1G93A που προήλθε από πρωτεϊνικό εκχύλισμα οσφυϊκής μοίρας νωτιαίου μυελού. Επιπλέον διαπιστώθηκε ότι οι θηλυκοί μύες Tg-SOD1G93AKlk6+/- παρουσίασαν ηπιότερα συμπτώματα από τους θηλυκούς μύες με γονότυπο Tg-SOD1G93A. Τέλος διαπιστώθηκε ότι η χορήγηση DMF στους μύες Tg-SOD1G93A αύξησε τα επίπεδα έκφρασης της Klk6 ενώ η επώαση των κυττάρων SH-SY5Y με KLK6R80Q ενεργοποίησε το μονοπάτι του Nrf2 το οποίο ενδεχομένως υποδηλώνει κάποια σχέση μεταξύ του Nrf2 και της KLK6.Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ότι θα μπορούσε δυνητικά να χρησιμοποιηθεί ο DMF για τη θεραπεία των ασθενών ALS που χαρακτηρίζονται από την παρουσία μεταλλάξεων στο γονίδιο SOD1 και κυρίως των θηλυκών ατόμων. Επίσης, η KLK6 είναι πιθανό να μετέχει στην εξέλιξη της νόσου SOD1 με πολλαπλούς μηχανισμούς που έχουν να κάνουν με την ενεργοποίηση του μονοπατιού του Nrf2 αλλά και με την πρωτεόλυση της SOD1. Παρόλα αυτά, η απαλοιφή του ενός αλληλομόρφου της Klk6 στα Tg-SOD1G93A είχε ως αποτέλεσμα μικρή βελτίωση του φαινοτύπου μόνο στους θηλυκούς μύες που υποδηλώνει και τη συμμετοχή άλλων άγνωστων προς το παρόν μονοπατιών εξαρτώμενων από την KLK6 στην SOD1-ALS. Τέλος δείχθηκε ότι η πρωτεΐνη SOD1G93A μπορεί να ακινητοποιηθεί σε σωματίδια πυριτικού ασβεστίου και έτσι να χρησιμοποιηθεί ως αντιγόνο σε μελλοντικούς εμβολιασμούς για τη θεραπεία των ασθενών SOD1-ALS.