Comparative genomics for probiotic traits in lactic acid bacteria derived from Greek fermented foods

Abstract

Greece has a plethora of unique traditional fermented foods many of which have Protected Designation of Origin (POD), such as Kalamata Olives. Fermentation has long been used to preserve and enhance the shelf-life, flavor, texture, and functional properties of food. Table olives in particular are well known for their sensory and nutritional properties, and more recently the microbiota of fermented olives has been suggested to contribute potential benefits in the gastrointestinal tract. These products enclose many aspects of the cultural and historical moments of the country and have always been an important part of Greek economy. Recently, there is the upcoming suggestion that fermented foods should be included as part of national dietary recommendations not only because of their long history, popularity, and culinary importance but also because they are healthier and, in some cases, environmentally friendly. Increasing interest in the human microbiome as a major determinant of human health underlines the need to understand the functions of microorganisms that enter the gastrointestinal tract (GI) through food and beverages. The objective of this research was to characterize new microbes as next generation probiotics, originating from traditional Greek foods and stool samples, by applying multi-omics approaches. Because microbiomes are fed by the same foods that we consume, we can develop foods with health-promoting ingredients that work by selectively feeding beneficial microbes or prohibiting growth of more harmful species. Fifty-seven wild type bacterial strains derived from Greek fermented foods (table olives, dried raisin, dried figs) and human stool samples were evaluated for probiotic properties. Identification of bacterial strains was conducted by sequencing the 16s rRNA gene. The 16S small subunit ribosomal gene is an exclusive housekeeping gene in prokaryotes, which can be used to determine microbial communities within samples. It is highly conserved and contains hypervariable regions ranging from region V1 to V9. Ten representative samples from the different food/stool sources, were selected to be whole genome sequenced (WGS). Three potential probiotic candidates amongst them, derived from Greek fermented table olives, were evaluated further in silico and in vitro experiments. The isolates all belonged to the species Lacticaseibacillus paracasei phylogenomic analysis revealed they clustered into three district clades. A pangenome analysis that included 220 Lc.paracasei genomes and the three olive isolates, combined with Carbohydrate-Active enzyme (CAZyme) database, led to identification of unique gene clusters and family enzymes relevant to their physiological role in fermented foods, as well as traits that may contribute to health benefits. Additionally, the source (dairy, non-dairy) and the geographical information (Asia, Europe, North America, South America, Africa) of each strain were screened and used for the classification of the Lc. paracasei species into three district clades. We also compared in-silico results with functional in vitro experiments to asses growth on different prebiotic substrates (fructooligosaccharides (FOS), galactooligosaccharides (GOS), xylooligosaccharides (XOS) and Inulin), growth in olive pumice and the production of inhibitory substances. Notably, consistent with the observed presence of the relevant CAZymes, the olive grew best on the two fructans, inulin and FOS, with cell densities even higher than glucose. These findings could lead to development of new functional foods and also to new probiotic strains that could provide health benefits to people with particular diseases.

Η Ελλάδα διαθέτει πληθώρα μοναδικών παραδοσιακών τροφίμων που έχουν υποστεί ζύμωση, πολλά από τα οποία έχουν προστατευμένη ονομασία προέλευσης (ΠΟΠ),όπως οι ελιές της Καλαμάτας. Αυτά τα προϊόντα περικλείουν πολλές πτυχές των πολιτιστικών και ιστορικών στιγμών της χώρας και αποτελούν ανέκαθεν σημαντικό μέρος της ελληνικής οικονομίας. Πρόσφατα, υπάρχει η επικείμενη πρόταση ότι τα τρόφιμα που έχουν υποστεί ζύμωση θα πρέπει να περιλαμβάνονται ως μέρος των εθνικών διατροφικών συστάσεων όχι μόνο λόγω της μακράς ιστορίας, της δημοτικότητάς τους και της μαγειρικής τους σημασίας, αλλά επίσης επειδή είναι υγιεινά και σε ορισμένες περιπτώσεις φιλικά προς το περιβάλλον. Η έρευνα της παρούσας διατριβής στοχεύει στην μελέτη νέων μη χαρακτηρισμένων στελεχών, ενδεχομένως με προβιοτικά χαρακτηριστικά, που προέρχονται από παραδοσιακές ελληνικές τροφές, με την επωνυμία της ελληνικής γαστρονομίας να προωθείται στη διατροφή του ανθρώπου. Επιπλέον, με τα αποτελέσματά της στοχεύει στη δημιουργία γνώσης και ανάπτυξης μοριακών εργαλείων που θα βοηθήσουν στην δημιουργία και εισαγωγή στην αγορά καινοτόμων λειτουργικών τροφίμων, συμβάλλοντας έμμεσα και άμεσα στην ελληνική οικονομία με την εξαγωγή ελληνικών προϊόντων στον υπόλοιπο κόσμο. Συγκεκριμένα, τα αποτελέσματα αυτής της εργασίας αναμένεται να αξιοποιηθούν άμεσα, καθώς ένα νέο λειτουργικό φαγητό, στα πλαίσια παραδοτέου ερευνητικής πρότασης, θα εισαχθεί στην αγορά. Επιπλέον, η κλινική δοκιμή που διεξήχθη θα υποστηρίξει περαιτέρω αυτό το έργο και θα παρέχει στοιχεία για τη συνέχιση της έρευνας πλεον της παρούσας διδακτορικής διατριβής. Προηγούμενες μελέτες αξιολόγησαν τα ανθρώπινα εντερικά μικροβιώματα μετά την κατάποση των προβιοτικών και έχουν δείξει πολλά υποσχόμενα αποτελέσματα για τη θεραπεία ασθενειών που σχετίζονται με το μικροβίωμα του εντέρου. Επιπλέον, οι μελέτες για τον εντοπισμό και την αξιολόγηση των ρόλων των προβιοτικών στις ασθένειες του εντέρου του ανθρώπου έχουν γίνει πιο έντονες τα τελευταία χρόνια. Παρόλο που εξακολουθούν να απαιτούνται ποικίλες μελέτες, προηγούμενες μελέτες καθώς και τρέχουσες μελέτες δείχνουν ότι τα προβιοτικά μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως πιθανές λύσεις για την πρόληψη ή τη θεραπεία ασθενειών που σχετίζονται με το ανθρώπινο έντερο. Σύμφωνα με την ταχεία ανάπτυξη των τεχνολογιών Next Generation Sequencing, οι μελέτες omics των επιλεγμένων προβιοτικών, που πιθανώς σχετίζονται με την ομοιόσταση του μικροβιώματος του εντέρου του ανθρώπου και ακόμη και τη ρύθμιση των εντερικών παθήσεων, προστέθηκαν πρόσφατα για να κατανοήσουν περαιτέρω τις επιπτώσεις τους στη διατήρηση και την προώθηση της ανθρώπινης υγείας. Αυτές οι διάφορες τεχνολογίες omics, συμπεριλαμβανομένης της μικροβιακής γονιδιωματικής, της μεταγραφικής, της μεταγονιδιωματικής, ακόμη και του μεταβολισμού, έχουν επεκτείνει τις γνώσεις μας σχετικά με την απομόνωση και την επιλογή νέων προβιοτικών στελεχών, την επαλήθευση των πραγματικών προβιοτικών επιδράσεών τους και ακόμη και των μοριακών μηχανισμών και την αξιολόγηση των επιδράσεών τους στην υγεία σε in vitro πειράματα καθώς και σε in vivo πειράματα(Seon-Kyun Kim et al., 2019). Επομένως, αυτές οι διευρυμένες πληροφορίες για τα προβιοτικά και οι επιπτώσεις τους στην υγεία του ανθρώπου σε επίπεδο omics θα αποτελούσαν βασικό κλειδί για την ανάπτυξη νέων προβιοτικών. Ωστόσο, η υπερβολική χρήση συγκεκριμένων προβιοτικών όπως το L. rhamnosus έχει αναφερθεί ότι προκαλεί βακτηριαιμία, σήψη ή ενδοκαρδίτιδα σε ασθενείς με σοβαρές φλεγμονές στα πεπτικά όργανα (Boyle R.J. et al., 2006). Επομένως, είναι σημαντικό να χορηγούνται κατάλληλες ποσότητες προβιοτικών όταν χρησιμοποιούνται σε συγκεκριμένους ασθενείς για θεραπευτικό σκοπό. Οι παραπάνω δραστηριότητες εφαρμόστηκαν με σκοπό να μελετηθούν μικροοργανισμοί που συμμετέχουν στη ζύμωση τροφίμων καθώς και δυνητικά προβιοτικοί μικροοργανισμοί και να προσδιοριστεί η μεταβολική τους δραστηριότητά με τη βοήθεια σύγχρονων και καινοτόμων μοριακών, αναλυτικών και υπολογιστικών μεθόδων (μεταγονιδιωματική – metagenomics, αλληλούχιση ολόκληρου του γονιδιώματος – Whole Genome Sequencing και βιοπληροφορική – bioinformatics) για την παραγωγή προϊόντων με βελτιωμένα ή/και νέα χαρακτηριστικά ως προς την ποιότητα και ασφάλεια. Το ερευνητικό πλάνο κατά το πρώτο έτος της διδακτορικής διατριβής ξεκίνησε με την εμβριθή βιβλιογραφική ανασκόπηση του θέματος και την κατανόηση των trends και της καινοτομίας της παρούσας έρευνας. Η αναζήτηση αυτή είναι συνεχής και διαρκής και περιλαμβάνει ένα ευρύ φάσμα θεμάτων και ενδιαφερόντων για την παρακολούθηση όλων των επιστημονικών εξελίξεων στο χώρο ενδιαφέροντος. Στη συνέχεια ξεκίνησε το πειραματικό σκέλος της διατριβής με τα πρώτα πειράματα για την αλληλούχιση του 16S του ριβοσωμικού RNA με τη μέθοδο Sanger (16S rRNA amplicon sequencing). Σκοπός αυτής της πειραματικής διαδικασίας είναι η ταυτοποίηση των μικροοργανισμών σε επίπεδο οικογένειας/γένους και η ταξινόμησή τους σε ομάδες. Ταυτοποιήθηκαν συνολικά πενήντα επτά βακτηριακά στελέχη. Τα πιο αντιπροσωπευτικά δείγματα προχώρησαν σε αλληλούχιση ολόκληρου του γονιδιώματος με δύο διαφορετικές μεθόδους Short reads, Illumina® MiSeq & NextSeq και Long reads, Oxford Nanopore MinION.Τα raw reads που παρήχθησαν αναλύθηκαν με τη χρήση λογισμικών (βιοπληροφορική ανάλυση), αρχικά για να συναρμολογηθεί το βακτηριακό γονιδίωμα (assembly) και στη συνέχεια να βρεθούν πιθανά προβιοτικά χαρακτηριστικά ή μη χαρακτηρισμένα ενζυμικά μονοπάτια. Η βιοπληροφορική ανάλυση συνεχίστηκε περαιτέρω στα ερευνητικά εργαστήρια των καθηγητών Hutkins και Yin στο Πανεπιστήμιο της Νεμπράσκα , στο Λινκολν στα πλαίσια συνεργασίας που έχει αναπτυχθεί Όπου και ιδιαίτερη έμφαση δόθηκε στα βακτήρια που προέρχονταν από επιτραπέζιες ελιές που έχουν προταθεί για πιθανά οφέλη στον γαστρενετερικό σωλήνα (Marco et al. 2017). Σε αυτή τη μελέτη, απομονώσαμε και προσδιορίσαμε την αλληλουχία των γονιδιωμάτων τριών πιθανών υποψήφιων προβιοτικών που προέρχονται από ελληνικές επιτραπέζιες ελιές που έχουν υποστεί ζύμωση. Τα απομονωμένα στελέχη ανήκαν όλα στο είδος Lacticaseibacillus paracasei, η φυλογονιδιωματική ανάλυση αποκάλυψε ότι συγκεντρώθηκαν σε τρία clades. Η ανάλυση πανγονιδιώματος που περιελάμβανε 220 γονιδιώματα Lc.paracasei και τα τρία απομονωμένα στελέχη ελιάς, σε συνδυασμό με τη βάση δεδομένων ενζύμων ενεργών υδατανθράκων (CAZyme), οδήγησε στον εντοπισμό μοναδικών συστάδων γονιδίων και οικογενειακών ενζύμων που σχετίζονται με τον φυσιολογικό τους ρόλο στα τρόφιμα που έχουν υποστεί ζύμωση, καθώς και χαρακτηριστικά που μπορούν να συμβάλουν σε οφέλη για την υγεία. Επιπρόσθετα, η πηγή (γαλακτοκομικό, μη γαλακτοκομικό) και οι γεωγραφικές πληροφορίες (Ασία, Ευρώπη, Βόρεια Αμερική, Νότια Αμερική, Αφρική) κάθε στελέχους εξετάστηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για την ταξινόμηση του Lc.paracasei σε τρία clades. Συγκρίναμε επίσης αποτελέσματα in-silico με λειτουργικά πειράματα in vitro για να αξιολογήσουμε την ανάπτυξη σε διαφορετικά πρεβιοτικά υποστρώματα (φρουκτοολιγοσακχαρίτες (FOS), γαλακτοολιγοσακχαρίτες (GOS), ξυλοολιγοσακχαρίτες (XOS) και ινουλίνη), την ανάπτυξη σε ελαιοπυρήνα (olive pumice) και την παραγωγή ανασταλτικών ουσιών. Συγκεκριμένα, σύμφωνα με την παρατηρούμενη παρουσία των ενζύμων CAZymes, η ελιά αναπτύχθηκε καλύτερα στις δύο φρουκτάνες, την ινουλίνη και το FOS, με κυτταρική πυκνότητα ακόμη μεγαλύτερη από τη γλυκόζη. Αυτά τα ευρήματα θα μπορούσαν να οδηγήσουν στην ανάπτυξη νέων λειτουργικών τροφίμων και επίσης σε νέα προβιοτικά στελέχη που θα μπορούσαν να προσφέρουν οφέλη για την υγεία σε άτομα με συγκεκριμένες ασθένειες.