Μελέτη του ρόλου της κυτταρικής γήρανσης στην νόσο COVID-19 με την χρήση χημικών αναλόγων του Sudan Black B

Abstract

Cellular senescence is a response mechanism to stress stimuli, the activation of which aims to maintain homeostasis. Senescent cells are characterized by a generally permanent arrest of the cell cycle, macromolecular damage, disrupted metabolism, and the secretion of a set of molecules termed SASP. Additionally, the senescent cells accumulate a mixture (an aggregate) consisting of by-products of its metabolism, called lipofuscin, constituting the "dark matter" of the senescent cell. Despite extensive research on cellular senescence field, there is a lack of tools/indicators that can accurately identify, living and fixed, senescent cells. Utilizing GL13, a hydrophobic biotinylated analog of Sudan Black-B (SBB), which accurately detects senescent cells by binding to lipofuscin, we developed the innovative reagent “GLF16”. GLF16 is a chemical analog of SBB coupled with fluorochrome, which, due to its structure, enables dissolution in aqueous solvents and opens a new field of study for senescence. The development of GLF16 reagent coincided with the onset of the COVID-19 pandemic caused by the SARS-CoV-2 virus. During viral infection, an acute inflammatory response is triggered mediated by key molecules such as IL-6, also found in the SASP of senescent cells. Furthermore, infected cells exhibit a similar phenotype to that of senescent cells. In this context, we investigated, using the GL13 and GLF16 reagents, to what extent the virus can induce the phenomenon of senescence during infection. In this frame, we investigated the role of senescent cells via SASP in the cytokine storm that characterize the pathogenesis of COVID-19 and their potential role in SARS-CoV-2 mutagenesis. The GLF16 reagent identified with high sensitivity and specificity fixed senescent cells both in vitro and in vivo in FFPE tissues. Moreover, it recognized fixed senescent cells using a multi-index approach with flow cytometry and FACS. The encapsulation of GLF16 into a mycellar nanocarrier allowed for the precise identification and analysis of live senescent cells with FACS, their analysis at the RNA and epigenome levels, as well as their in vivo detection in established mouse senescence models. Exploiting GLF16 reagent parallel to GL13, we identified for the first time the induction of cellular senescence following SARS-CoV-2 infection in vitro and in vivo. Additionally, senescent and infected cells exhibited high levels of IL-6 and IL-1β, indicating the contribution of SASP to the observed hyper-inflammatory response in COVID-19. Furthermore, these cells overexpressed enzymes of the APOBEC family involved in RNA editing. The overexpression of these enzymes, coupled with the prolonged presence of the virus within senescent cells due to their resistance to apoptosis, revealed their role as a reservoir for generating new virus mutations. In summary, the development of the innovative GLF16 reagent allowed for the first time the detection and further analysis of live and fixed senescent cells at the RNA and epigenome levels. GLF16 was simultaneously utilized with GL13 to study cellular aging following SARS-CoV-2 infection. The role of senescent cells was identified in both pathogenesis and virus mutagenesis, rendering them a potential therapeutic target, with senolytic drugs as a complementary treatment alongside existing ones.

Η κυτταρική γήρανση συνιστά ένα μηχανισμό απόκρισης στα στρεσσογόνα ερεθίσματα η ενεργοποίηση του οποίου στοχεύει στην διατήρηση της ομοιόστασης. Τα γηρασμένα κύτταρα χαρακτηρίζονται από την γενικά μόνιμη καθήλωση του κυτταρικού κύκλου, βλάβη στα μακροκομόρια, διαταραγμένο μεταβολισμό καθώς και την έκκριση ενός συνόλου μορίων που καλούνται SASP. Επιπλέον, το γηρασμένο κύτταρο συσσωρεύει ένα μείγμα αποτελούμενο από παραπροϊόντα του μεταβολισμού που ονομάζεται λιποφουσκίνη και αποτελεί την «μαύρη ύλη» του γηρασμένου κυττάρου. Παρά τη μακροχρόνια έρευνα του φαινομένου της κυτταρικής γήρανσης από την φαρέτρα των ερευνητών απουσιάζει ένα εργαλείο/δείκτης που μπορεί να αναγνωρίζει τα ζωντανά και τα μονιμοποιημένα γηρασμένα κύτταρα με ακρίβεια. Αξιοποιώντας το GL13, ένα υδρόφοβο βιοτυνιλιομένο ανάλογο του Sudan Black-B (SBB), που ανιχνεύει τα γηρασμένα κύτταρα μέσω της σύνδεσης του στη λιποφουσκίνη αναπτύξαμε το καινοτόμο αντιδραστήριο “GLF16”. Το GLF16 είναι ένα χημικό ανάλογο του SBΒ συζευγμένο με μια φθορίζουσα ομάδα το οποίο λόγω της δομής του, η οποία του προσδίδει την ικανότητα να διαλυτοποιείται σε υδατικούς διαλύτες, ανοίγει ένα νέο πεδίο μελέτης του γηρασμένου κυττάρου. Η ανάπτυξη του αντιδραστηρίου GLF16 συνέπεσε με την εκδήλωση της πανδημίας COVID-19 η οποία οφείλεται στον ιό SARS-CoV-2. Κατά την λοίμωξη από τον ιο πυροδοτείται μια οξεία φλεγμονώδης απάντηση η οποία μεσολαβείται από μόρια κλειδιά όπως η IL-6 που εντοπίζεται και στο εκκρινόμενο SASP των γηρασμένων κυττάρων. Επιπλέον τα μολυσμένα κύτταρα παρουσιάζουν έναν παρόμοιο φαινότυπο με εκείνον του γηρασμένου κυττάρου. Στο πλαίσιο αυτό διερευνήσαμε, αξιοποιώντας τo αντιδραστήριo GLF16 αλλά και το GL13, κατά πόσο δύναται ο ιός δύναται να επάγει το φαινόμενο της γήρανσης κατά την μόλυνση του κυττάρου ξενιστή. Υπό αυτό το πρίσμα, μελετήθηκε η συμβολή του γηρασμένου κυττάρου μέσω του SASP στον καταρράκτη κυτοκινών που χαρακτηρίζει την παθογένεια της νόσου COVID-19 καθώς και ο πιθανός ρόλος των γηρασμένων κυττάρων στη μεταλλαξιγένεση του ιού. Το αντιδραστήριο GLF16 ταυτοποίησε με υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα τα μονιμοποιημένα γηρασμένα κύτταρα τόσο in vitro όσο και in vivo σε FFPE ιστούς. Επιπλέον, αναγνώρισε τα μονιμοποιημένα γηρασμένα κύτταρα μέσω μιας προσέγγισης πολλαπλών δεικτών με κυτταρομετρίας ροής και FACS. Η έγκλιση του GLF16 σε ένα μυκήλλιο-νανοφορέα επέτρεψε την ταυτοποίηση και ανάλυση για πρώτη φορά με ακρίβεια των ζωντανών γηρασμένων κυττάρων με FACS, την ανάλυση τους σε επίπεδο RNA και επιγενώματος καθώς και τον εντοπισμό τους in vivo σε καθιερωμένα μοντέλα γήρανσης ποντικών. Έχοντας αναπτύξει και επιβεβαιώσει την ικανότητα του αντιδραστήριού GLF16 να αναγνωρίζει τα γηρασμένα κύτταρα, εφαρμόστηκε παράλληλα με το GL13 και εντοπίσαμε για πρώτη φορά την επαγωγή της κυτταρικής γήρανσης ύστερα από την μόλυνση από τον ιό SARS-CoV-2 in vitro και in vivo. Επιπλέον, τα γηρασμένα και μολυσμένα κύτταρα παρουσίασαν υψηλά επίπεδα IL-6 και IL-1β υποδεικνύοντας την συνεισφορά του SASP στην υπερφλεγμονώδη αντίδραση που παρατηρείται κατά τη νόσο COVID-19. Επιπροσθέτως, τα συγκεκριμένα κύτταρα υπερέκφραζαν ισομορφές των ενζύμων της οικογένειας APOBEC όπου μεσολαβούν στη επεξεργασία RNA υποστρωμάτων. Η υπερέκφραση αυτών συνδυαστικά με την παρατεταμένη παραμονή του ιού εντός των γηρασμένων κυττάρων λόγω της ανθεκτικότητας που παρουσιάζουν στην απόπτωση ανέδειξε ότι λειτουργούν ως μια δεξαμενή παραγωγής νέων μεταλλάξεων του ιού SARS-CoV-2. Συνοψίζοντας, η ανάπτυξη του καινοτόμου αντιδραστηρίου GLF16 επέτρεψε για πρώτη φορά την ανίχνευση και περαιτέρω ανάλυση των ζωντανών και μονιμοποιημένων γηρασμένων κυττάρων σε επίπεδο RNA και επιγενωμάτος. To GLF16 αξιοποιήθηκε ταυτόχρονα με το GL13 για την μελέτη της κυτταρικής γήρανσης ύστερα από την μόλυνση με τον SARS-CoV-2. Ταυτοποιήθηκε, έτσι, ο ρόλος των γηρασμένων κυττάρων τόσο στην παθογένεια όσο στη μεταλλαξιγένεση του ιού καθιστώντας τα έναν εν δυνάμει θεραπευτικό στόχο και τα σενολυτικά φάρμακα ως μια συμπληρωματική θεραπεία της νόσου COVID-19 παράλληλα με τις υπάρχουσες.