Investigation of the α-synuclein transfer of pathology in PD models

Abstract

α-synuclein, a small pre-synaptic neuronal protein, is both biochemically and genetically linked with Parkinson’s Disease (PD) pathogenesis. α-synuclein was considered an exclusively cytoplasmic protein, until several studies confirmed its presence in the extracellular space. However, the mechanism of α-synuclein release is still unclear either under normal or pathological conditions. The levels of extracellular α-synuclein is of great importance since it has been implicated in the cell-to-cell propagation of pathology between interconnected brain areas, a prominent characteristic of the PD brain. The first part of this thesis focused on the identification and pharmacological targeting of the specific Voltage-gated Calcium Channels (VGCCs) that mediate α-synuclein release both in vitro and in vivo. Initially, the mechanism of α-synuclein secretion was studied in vitro by application of different selective VGCCs blockers into mouse embryonic cortical neurons and quantification of secreted α-synuclein by an in house ELISA. The functionality of the blockers was confirmed by live calcium imaging in cortical neurons. In vivo, a-synuclein release was studied in transgenic mice expressing the human A53T mutant form of α-synuclein. In these mice, the involvement of each VGCC type in α-synuclein secretion was assessed by local administration of each specific VGCC blocker by in vivo reverse microdialysis. The results obtained from this study indicate that α-synuclein secretion in vitro and in vivo is a VGCC-dependent process, which in mouse striatum, is modulated, at least in part, by the N-type VGCCs, whereas the L and P/Q-type VGCCs are not probably involved.α-synuclein secretion is a physiological process in neurons. However, abnormal α-synuclein secretion could promote its aggregation, which has been linked with sustained neuroinflammation in PD, aggravating neuronal degeneration. Even though α-synuclein can be phagocytosed by microglia and/or astrocytes, the molecular pathways that trigger and prolong inflammation in the PD brain remain unclear. In the second part of the thesis, the human α-synuclein A53T transgenic mouse model was used to investigate α-synuclein derived neuroinflammation. This model expresses high levels of both oligomeric and monomeric a-synuclein and exhibits sustained inflammatory responses as indicated by significant elevations in the levels of endogenous IgG antibodies and pro-inflammatory cytokines (TNFα, IFNγ and IL1β). In vitro experiments on primary microglial cells indicated that the oligomeric, but not monomeric, α-synuclein conformers were able to activate microglia as shown by NF-κB activity and increased TNFα release. Further characterization of the inflammatory environment in A53T striatum by using 3D cell reconstruction and morphometric analysis of the GFAP+ astrocytes revealed increased number and distinct morphological alterations in the A53T mice compared to wild type mice. Subsequent analysis of the striatum of A53T mice using immunofluorescence and immunoblotting revealed an activation of the p38MAPK pathway in microglia that stimulated the NF-κB pathway in astrocytes. Aberrant astrocytic calcium signaling has been linked with the pathogenesis of several neurodegenerative diseases and could contribute to the initiation or sustenance of neuroinflammation. To assess astrocytic calcium signaling, fluorescence measurements in individual GFAP+ astrocytes were performed. This approach revealed a significant increase in the levels of Cav3.2 T-type VGCCs in the striatum of A53T mouse compared with wt littermates. To investigate the molecular link between inflammatory responses and Cav3.2 induction, mouse primary quiescent astrocytes were treated with cytokines and Cav3.2 was assessed by immunoblotting. These experiments showed that TNFα and IL-1β can potently induce functional Cav3.2 channels in a NF-κB-dependent manner. Secretomic analysis in quiescent astrocytes overexpressing the Cav3.2 VGCCs highlighted the secretion of Insulin-like growth factor-binding protein-like 1 (IGFBPL1), a potent regulator of neuronal axonal growth. Overall, the identification of a specific type of VGCC as a regulator of α-synuclein secretion set the grounds for the selective pharmacological targeting of this channel to control the levels of secreted α-synuclein. Increased expression of α-synuclein could result in elevated extracellular levels of the protein which in turn promotes the accumulation of aberrant oligomeric species inducing neuroinflammatory responses. The data provided here suggest that the elevation of astrocytic Cav3.2 VGCCs could act as a compensatory mechanism that protect neurons from α-synuclein-induced inflammation via boosting IGF1 signalling.

Η α-συνουκλεΐνη είναι μια μικρή προ-συναπτική νευρωνική πρωτεΐνη, βιοχημικά και γενετικά συνδεδεμένη με τη εμφάνιση παθολογίας στη Νόσο Πάρκινσον (ΝΠ). Για αρκετά χρόνια θεωρούνταν ότι η α-συνουκλεΐνη βρίσκεται αποκλειστικά στο κυτταρόπλασμα των νευρικών κυττάρων μέχρι που πρόσφατες μελέτες έδειξαν την ύπαρξή της στον εξωκυττάριο χώρο. Ωστόσο, παρόλο που η α-συνουκλεΐνη έχει εντοπιστεί εξωκυττάρια, δεν διαθέτει πεπτίδιο αναγνώρισης για έκκριση προκειμένου να ακολουθεί το κλασσικό μονοπάτι έκκρισης πρωτεϊνών και μέχρι σήμερα δεν έχει αποσαφηνιστεί ο μηχανισμός έκκρισης της, υπό φυσιολογικές ή/και παθολογικές συνθήκες. Τα επίπεδα εξωκυττάριας α-συνουκλεΐνης έχουν σημαντικό ρόλο αφού έχουν ενοχοποιηθεί για την μετάδοση της παθολογίας από κύτταρο σε κύτταρο στις διαφορετικές περιοχές του εγκεφάλου που χαρακτηρίζει την εξέλιξη της ΝΠ. Το πρώτο μέρος της παρούσας μελέτης επικεντρώνεται στη διερεύνηση του μοριακού μονοπατιού για την έκκριση της α-συνουκλεΐνης στον εγκέφαλο μυών, το οποίο ενεργοποιείται από την αύξηση των ενδοκυττάριων επιπέδων ασβεστίου μέσω των τασεο-ελεγχόμενων διαύλων ασβεστίου (Voltage-gated Calcium Channels, VGCCs), με έμφαση στην ταυτοποίηση και στόχευση των συγκεκριμένων VGCCs τόσο in vitro όσο και in vivo. Αρχικά, ο μηχανισμός έκκρισης της α-συνουκλεΐνης μελετήθηκε με τη διεξαγωγή in vitro πειραμάτων σε εμβρυϊκούς φλοιικούς νευρώνες μυών, όπου τα επίπεδα της εκκρινόμενης α-συνουκλεΐνης ποσοτικοποιήθηκαν με μια ειδική για την α-συνουκλεΐνη ELISA, μετά την εφαρμογή εκλεκτικών αναστολέων για κάθε τύπο VGCC. Η λειτουργικότητα των αναστολέων επιβεβαιώθηκε με φθορισμομετρική μέτρηση της συγκέντρωσης του ασβεστίου σε πραγματικό χρόνο σε λειτουργικούς εμβρυϊκούς φλοιικούς νευρώνες μυών. In vivo, η έκκριση της α-συνουκλεΐνης μελετήθηκε σε διαγονιδιακούς μύες που εκφράζουν την ανθρώπινη A53T μεταλλαγμένη μορφή της α-συνουκλεΐνης. Η συμμετοχή των VGCCs στην έκκριση της α-συνουκλεΐνης εκτιμήθηκε ύστερα από τοπική χορήγηση ειδικών αναστολέων μέσω in vivo αντίστροφης μικροδιύλυσης στο ραβδωτό σώμα των Α53Τ μυών. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν από τα παραπάνω πειράματα έδειξαν ότι η έκκριση της α-συνουκλεΐνης in vitro και in vivo είναι μια διαδικασία που εξαρτάται από τα VGCCs και η οποία στο ραβδωτό σώμα των μυών φαίνεται να ρυθμίζεται, τουλάχιστον σε μεγάλο βαθμό, από τα VGCCs τύπου Ν, ενώ τα VGCCs τύπου L και P/Q δεν φαίνεται να επηρεάζουν την έκκριση της α-συνουκλεΐνης. Η έκκριση της α-συνουκλεΐνης είναι μία φυσιολογική λειτουργική απόκριση των νευρικών κυττάρων. Όμως, η μη φυσιολογική έκκριση της α-συνουκλεΐνης πιθανόν να οδηγεί στη δημιουργία συσσωματωμένων δομών που επάγουν τη νευροφλεγμονή επιδεινώνοντας περαιτέρω τον νευροεκφυλισμό που παρατηρείται στους ασθενείς με ΝΠ. Παρόλο που είναι γνωστό ότι η α-συνουκλεΐνη μπορεί να φαγοκυτταρωθεί από τη μικρογλοία και/ή τα αστροκύτταρα και να οδηγήσει σε έναρξη της νευροφλεγμονής, τα μοριακά μονοπάτια που πυροδοτούν και παρατείνουν τη φλεγμονή στον εγκέφαλο των ασθενών με ΝΠ, παραμένουν ασαφή. Στο δεύτερο μέρος της διατριβής, προκειμένου να ελεγχθεί ο ρόλος της συσσωμάτωσης της α-συνουκλεΐνης στην επαγωγή νευροφλεγμονής, χρησιμοποιήθηκε το διαγονιδιακό μοντέλο της Α53Τ α-συνουκλεΐνης στο οποίο τα15νευρικά κύτταρα εκφράζουν υψηλά επίπεδα συσσωματωμένης/ολιγομερούς α-συνουκλεΐνης και παρουσιάζουν αυξημένους δείκτες νευροφλεγμονής. Μέσω συνδυασμού μοριακών και βιοχημικών τεχνικών, η παρουσία ολιγομερών α-συνουκλεΐνης συσχετίστηκε με παρατεταμένες φλεγμονώδεις αποκρίσεις, όπως έδειξαν οι σημαντικές αυξήσεις στα επίπεδα των ενδογενών IgG αντισωμάτων στους Α53Τ μύες, καθώς και των προ-φλεγμονωδών κυτταροκινών (TNFα, IFNγ και IL1β). Με χρήση ανοσοφθορισμού και ειδικής για το TNFα ELISA σε πρωτογενείς καλλιέργειες μικρογλοίας, επιβεβαιώθηκε ότι η ολιγομερής, και όχι η μονομερής, μορφή της α-συνουκλεΐνης είναι εκείνη που ενεργοποιεί τη μικρογλοία. Σε επόμενα πειράματα μέσω τρισδιάστατης κυτταρικής ανακατασκευής, η μορφομετρική ανάλυση των αστροκυττάρων που ήταν θετικά έναντι στον αστροκυτταρικό δείκτη GFAP αποκάλυψε αυξημένο αριθμό αστροκυττάρων και διακριτές μορφολογικές αλλοιώσεις στα αστροκύτταρα του ραβδωτού σώματος των A53T μυών, σε σύγκριση με τους μύες άγριου τύπου. Περαιτέρω ανάλυση με χρήση ανοσοφθορισμού και ανοσοαποτύπωσης κατά Western αποκάλυψε την ενεργοποίηση του p38MAPK σηματοδοτικού μονοπατιού στη μικρογλοία καθώς και τη διέγερση του NF-κB σηματοδοτικού μονοπατιού στα αστροκύτταρα. Μελέτες μέτρησης ανοσοφθορισμού σε μεμονωμένα GFAP+ αστροκύτταρα έδειξαν επίσης αυξημένη έκφραση των Cav3.2 καναλιών ασβεστίου στο ραβδωτό σώμα των A53T μυών, σε σύγκριση με τους μύες άγριου τύπου. Για τη περαιτέρω διερεύνηση του μοριακού μηχανισμού επαγωγής των αστροκυτταρικών Cav3.2 καναλιών ασβεστίου στους Α53Τ μύες, χρησιμοποιήθηκαν πρωτογενή αστροκύτταρα μυών που βρίσκονταν σε κατάσταση ηρεμίας. Χορήγηση κυτταροκινών στα πρωτογενή αστροκύτταρα οδήγησε σε ενεργοποίηση του NF-κB μονοπατιού και αύξηση των επιπέδων λειτουργικών Cav3.2 καναλιών ασβεστίου αποδεικνύοντας τη συσχέτιση των Cav3.2 καναλιών ασβεστίου με την επαγωγή του NF-κB. Για να βρεθεί ποιες αστροκυτταρικές πρωτεΐνες εκκρίνονται μέσω του Cav3.2 διαύλου, έγινε πρωτεομική ανάλυση με LC-MS/MS του εκκριτικού περιβάλλοντος αστροκύτταρων, ύστερα από υπερεκφράση του Cav3.2 καναλιού ασβεστίου. Μέσω αυτής της πειραματικής προσέγγισης, αναδείχτηκε η έκκριση της πρωτεΐνης, IGFBPL1, η οποία αποτελεί ισχυρό ρυθμιστή της αξονικής ανάπτυξης των νευρώνων. Εν κατακλείδι, η ταυτοποίηση του ρυθμιστικού ρόλου που παίζει ένας συγκεκριμένος τύπος καναλιού ασβεστίου στην έκκριση της α-συνουκλεΐνης, θέτει τις βάσεις για την επιλεκτική φαρμακολογική στόχευση αυτού του καναλιού, με σκοπό να ρυθμιστούν τα επίπεδα της εκκρινόμενης α-συνουκλεΐνης. Όταν η α-συνουκλεΐνη υπερ-εκκρίνεται στο διάμεσο υγρό του εγκεφάλου, τότε ευνοείται η συσσώρευσή της, η οποία οδηγεί σε δημιουργία νευροφλεγμονής. Τα δεδομένα της πρωτεομικής μαζί με την απουσία νευρωνικού θανάτου στους A53T μύες υποδηλώνουν ότι η αύξηση των επιπέδων του αστροκυτταρικού Cav3.2 καναλιού λειτουργεί ως αντισταθμιστικός μηχανισμός που προστατεύει τους νευρώνες από τη φλεγμονή που προέρχεται από την συσσώρευση των ολιγομερών μορφών της α-συνουκλεΐνης.