Μέτρηση πάχους μέσου χιτώνα κοιλιακής αορτής και συσχέτιση του με δείκτες οξειδωτικού στρες (μελέτη TXNIP σε πλακούντα και ομφάλιο αίμα) σε νεογνά διαβητικών μητέρων

Abstract

Introduction: Gestational diabetes mellitus GDM is commonly defined as any degree of glucose intolerance recognized during pregnancy. GDM prevalence ranges between 1-14%, depending on the population studied and the diagnostic tests used. An increasing trend is observed over the past decades. It is estimated that by 2030, the prevalence of GDM may reach 30% of all pregnancies. Since GDM is associated with health complications for both mother and offspring, it implies substantial implications for public health with both social and economic burden. The disturbance in glucose metabolism in pregnant women results in the impairment of many biochemical pathways. Consequently, the cell is exposed to enhanced oxidative stress, cellular antioxidant defense systems are activated, and inflammation ensues. Αlthough placenta appears to act as a barrier, exposure of the fetus to this biochemical cascade, has important implications. Assessment of oxidative stress is accomplished via measurement of either the amount of antioxidant systems or the derivatives of overwhelming oxidation of cellular molecules. One of the well-recognised antioxidant systems is that of NADPH- Thioredoxin -Thioredoxin Interacting Protein (TXNIP). TXNIP is induced by hyperglycemia and results in increase of the oxidative stress and inflammation, dysfunction of pancreatic beta cells and atherogenesis. Primary goal of this research proposal is to examine the TXNIP expression on placenta and umbilical blood and how this may be altered in pregnancies complicated with GDM. The manifestation of metabolic syndrome in adult life of off springs of women with GDM has been recognised as a long term consequence of GDM. Atherosclerosis is one of the main consequences of metabolic syndrome. Long before clinical overt atherosclerosis develops, a subclinical endothelial injury that may last for decades is visible as a thickening of the intima media of great and medium size vessels. Τhe thioredoxin system consists of NADPH, thioredoxin reductase (TrxR) and thioredoxin (Trx) and is a key antioxidant system. Thioredoxin act as an antioxidant via two cysteine residues of the active site (disulfide domains) reducing NADP to NADPH. Thioredoxin interactive protein (TXNIP) is a component of this system that bounds thioredoxin and renders it unable to fulfill its antioxidant role . Consequently, an increase in TXNIP results in increase of the total oxidative burden of the cell. Previous studies have made clear the association between gestational diabetes mellitus and metabolic syndrome in offspring΄s adult life. That is probably one of the most well-known long term complications of GDM at the fetus. Major components of metabolic syndrome include atherosclerosis, obesity, glucose intolerance and type 2 DM. Increased IMT of abdominal aorta is considered a more sensitive marker in detection of early atherosclerosis compared to IMT of carotid artery .OBJECTIVE: Focused on the long term consequences of gestational diabetes mellitus and since offspring of DGM women manifest with greater probability metabolic syndrome in adult life, we aim to study the presence of proatheromatic lesions in neonates and correlate them with possible biochemical markers based on the current knowledge in the pathophysiology of diabetes. Our objective was to explore the prognostic role of abdominal aorta intima-media thickness (aIMT) in neonates exposed to GDM as a possible biomarker for later atherogenesis and its possible correlation with thioredoxin-interacting protein (TXNIP), a protein involved in oxidative stress. METHODS: 1) Study design. In this prospective, observational study, mother-infant pairs were studied in 2 groups (57 patients with GDM and 51 controls without GDM). In the study are enrolled women of singleton pregnancy, of Caucasian origin who are in a follow up in the outpatient clinic in the 3rd Clinic of Obstetrics and Gynecology of UOA. During follow up visits anthropometric data (height, body weight, weight gain during pregnancy, BMI calculation) and biochemical parameters are registered. In the visit at 24-28weeks OGTT test will be performed (75gr glucose load-glucose measurement at O- 1 hour-2 hours from glucose load). GDM was diagnosed according to IADPSG criteria TXNIP levels were measured in the placenta, as well as in the umbilical and neonatal blood. The data were correlated with aIMT in neonates. 2) Sample collection at labor Collection of the placenta and umbilical blood samples is done within minutes from labor and was stored at -80C until further processing. Samples from placenta lysates near the umbilical was investigated, for TXNIP protein with Western blot. Placenta residuals was stored in formalin. Pathology study of TXNIP protein with immunohistochemistry (in situ hybridization with fluorescent antibodies) has taken place in these residuals intersections, in places near the above mentioned spots. Samples of umbilical blood are centrifigured and serum was examined for TXNIP with ELISA test and biochemical parameters (vit D, TG, Chol, glu and insulin).3) Neonatal examination. The neonates were examined at the 3rd to 10th day of life, and birth weight, BMI and ponderal index was recorded. Neonatal blood samples were examined for TXNIP with ELISA method. The thickness of intima-media of abdominal aorta in neonates was measured by an experienced pediatric radiologist at the 3rd to 10th day of life, using the ultrasound system Mindray DC-8 expert (Shenzhen, P. R. China), with linear probe 3-12 Hz and automated IMT program. Ultrasound examination of the abdominal aorta is a non-invasive and well tolerated method for neonates. aIMT is measured twice in a straight non-branched longitudinal segment of abdominal aorta, distal to kidney arteries and above aortic bifurcation according to Mannheim consensus for measurement of IMT in carotid arteries. RESULTS: In our study body weight of the mother and BMI of mother as birth weight of the neonates were not statistically different between the 2 groups (patients and controls). aIMT was increased in GDM offspring (patients: median [range]=0.39 mm [0.31-0.46] vs controls: median=0.28 mm [0.23-0.33]; p=0.001) and remained significant after adjusting for possible confounders (e.g., triglycerides, blood pressure, vitamin D, birth weight and gender) with cases having 0,13 points higher IMT value than controls (95% CI: 0.001-0.261 p=0.049).AIMT was not statistically significant different in off springs of patients treated with insulin than in patients treated with diet only. In total TXNIP levels in the placenta, as recorded with total-TXNIP h score in immunohistochemistry were significantly associated with GDM (p=0.001). TXNIP levels were increased in trophoblasts (p=0.001) and syncytiotrophoblasts (p=0.001) and were decreased in endothelial cells (p=0.022) in GDM offspring vs controls. Moreover, TXNIP levels in trophoblasts positively correlated with aIMT (r=0.369; p=0.001). TXNIP levels in umbilical/neonatal blood measured with ELISA and placenta TXNIP measured with Western blot was not associated with GDM. CONCLUSIONS: Increased aIMT was demonstrated in the offspring of mothers with GDM. Non-invasive measurement of aIMT could be used as a biomarker to identify children at increased risk for atherogenesis later in life. TXNIP may be associated with GDM and/or aIMT but more studies are needed to examine this relationship. Early detection of high-risk population is a prerequisite for preventing intervention at suitable time points. The population of children at high risk need to be in a more concrete pediatric follow up with scheduled anthropometric and arterial pressure measurements along with parents-child consultation for potential dietary interventions and adoption of a heathy lifestyle. Data from recent studies have illustrated the link between food supplements – such as antioxidants ex quercetin, curcumin - and reduction of oxidative stress, showed by reduction of TXNIP levels. Τherefore identification of high risk population is important for future studies concerning dietary interventions and possible drug therapy

Εισαγωγή: Ως σακχαρώδης διαβήτης κύησης (ΣΔΚ) ορίζεται η μειωμένη ανοχή στη γλυκόζη που πρωτοεμφανίζεται κατά την κύηση. Το μέγεθος της επίπτωσης ποικίλει από 1-14%, ανάλογα με τον υπό εξέταση πληθυσμό και τη διαγνωστική δοκιμασία που χρησιμοποιείται, με αυξητικές τάσεις. Καθώς ο σακχαρώδης διαβήτης κύησης έχει συσχετιστεί με σοβαρές επιδράσεις στην υγεία της μητέρας αλλά και του βρέφους, συνεπάγεται και σοβαρές επιπτώσεις στη συνολική υγεία του πληθυσμού, με κοινωνικές αλλά και οικονομικές προεκτάσεις. Η διαταραχή στο μεταβολισμό της γλυκόζης στη μητέρα έχει ως αποτέλεσμα την προσβολή πολλών βιοχημικών μονοπατιών, με αποτέλεσμα, το κύτταρο να δέχεται αυξημένο φορτίο οξειδωτικού στρες, να αυξάνονται τα αντιοξειδωτικά συστήματα εντός του κυττάρου και να ενεργοποιείται η φλεγμονή. Αν και ο πλακούντας αποτελεί κάποιο φραγμό στη μεταφορά του οξειδωτικού στρες, ο βιοχημικός αυτός καταρράκτης επηρεάζει και το έμβρυο.Για τη μέτρηση του οξειδωτικού στρες χρησιμοποιούμε είτε τη μέτρηση των αντιοξειδωτικών συστημάτων είτε τα παράγωγα παθολογικής οξείδωσης μορίων. Ένα αναγνωρισμένο αντιοξειδωτικό σύστημα είναι το σύστημα θειορεδοξίνης- NADPH-δεσμευτικής της θειορεδοξίνης πρωτεΐνης TXNIP. H πρωτεΐνη TXNIP επάγεται από την υπεργλυκαιμία και προκαλεί η ίδια αύξηση του οξειδωτικού στρες και της φλεγμονής, δυσλειτουργία των κυττάρων του παγκρέατος και αθηροσκλήρυνση. Ως μια από τις μακροχρόνιες επιπτώσεις του διαβήτη κύησης, έχει αναγνωριστεί η εμφάνιση μεταβολικού συνδρόμου στην ενήλικη ζωή των απογόνων. Η αθηροσκλήρυνση αποτελεί μια βασική συνέπεια του μεταβολικού συνδρόμου. Πριν την εμφάνιση κλινικής αθηρωμάτωσης υπάρχει για πολλά χρόνια λανθάνουσα βλάβη του ενδοθηλίου που γίνεται εμφανής ως πάχυνση του μέσου χιτώνα των αγγείων μέσου και μεγάλου μεγέθους. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει πρώιμες αθηρωματικές βλάβες (πάχυνση του μέσου χιτώνα της κοιλιακής αορτής) τόσο σε νεογνά μικρά για την ηλικία κύησης όσο και σε μακροσωμικά νεογνά, τα οποία έχουν αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης μεταβολικού συνδρόμου στην ενήλικο ζωή. Σκοπός: Επικεντρωμένοι στις μακροχρόνιες επιπτώσεις του ΣΔΚ και δεδομένου ότι τα παιδιά αυτά εμφανίζουν σε μεγαλύτερο ποσοστό μεταβολικό σύνδρομο στην ενήλικη ζωή, θέλουμε να ερευνήσουμε την παρουσία προαθηρωματικών βλαβών στα νεογνά και να τις συσχετίσουμε με πιθανούς βιοχημικούς δείκτες με βάση τις έως τώρα γνώσεις μας για την παθοφυσιολογία του ΣΔΚ. Για το σκοπό αυτό μετράμε •την παρουσία του TXNIP σε επίπεδο πρωτεΐνης στον πλακούντα των εγκύων αλλά και το ομφάλιο αίμα •το πάχος του μέσου χιτώνα της κοιλιακής αορτής των νεογνών. Μέθοδος: 1)Σχεδιασμός μελέτηςΠρόκειται για μια προοπτική, μελέτη παρατήρησης με 2 ομάδες ασθενών -μαρτύρων ( 57 ζεύγη ασθενών μητέρας-νεογνού με ΣΔΚ και 51 ζεύγη μητέρας-νεογνού μαρτύρων χωρίς ΣΔΚ). Στη μελέτη εντάχθηκαν γυναίκες με μονήρη κύηση, καυκάσιας φυλής που τελούσαν σε παρακολούθηση στα εξωτερικά ιατρεία της Γ Μαιευτικής και Γυναικολογικής κλινικής του ΕΚΠΑ. Κατά τη διάρκεια της παρακολούθησης καταγράφηκαν ανθρωπομετρικά χαρακτηριστικά (ύψος, βάρος, πρόσληψη βάρους κατά τη διάρκεια της κύησης, υπολογισμός ΒΜΙ) και βιοχημικές παράμετροι. Στις 22-24 EK εκτελέστηκε δοκιμασία ανοχής γλυκόζης με φόρτιση με 75 γρ γλυκόζης και μέτρηση στο χρόνο 0΄,60΄,120΄και έγινε η διάκριση σε ασθενείς και μάρτυρες σύμφωνα με τα κριτήρια του IADPSG για το ΣΔΚ. Τα επίπεδα του TXNIP μετρήθηκαν στον πλακούντα και στο ομφάλιο αίμα καθώς και στο αίμα του νεογνού. Τα στοιχεία συσχετίστηκαν με τη μέτρηση του aIMT στα νεογνά. 1) συλλογή δειγμάτων κατά τη γέννησηΣυλλέχθηκαν δείγματα από τον πλακούντα και το ομφάλιο αίμα αμέσως μετά τη γέννηση και μετά την επεξεργασία ετέθησαν σε βαθιά κατάψυξη για περαιτέρω επεξεργασία (-80C). Δείγματα από πλακούντα δίπλα από την έκφυση του ομφαλίου λώρου εξετάστηκαν με Western blot για επίπεδα της πρωτεΐνης του TXNIP. Άλλο τεμάχιο πλήρους πάχους του πλακούντα αποθηκεύτηκε σε φορμόλη για παθολογοανατομική εξέταση. Συγκεκριμένα έγιναν αναλύσεις ανοσοϊστοχημείας ( in situ υβριδισμός με φθορίζοντα αντισώματα) σε τομές δίπλα από τις προαναφερθείσες. Τα δείγματα από το ομφάλιο αίμα φυγοκεντρήθηκαν , καταψύχθηκαν και ελέγχθηκαν με ELISA για τα επίπεδα του TXNIP αλλά και για βιοχημικές παραμέτρους (vitD, τριγλυκερίδια, χοληστερόλη, γλυκόζη και ινσουλίνη). 2) Εξέταση νεογνών. Τα νεογνά εξετάστηκαν την 3η-10η ημέρα ζωής και καταγράφηκαν ανθρωπομετρικά στοιχεία όπως το βάρος γέννησης και το ponderal index. Δείγματα νεογνικού αίματος ελέγχθηκαν για επίπεδα TXNIP με τη μέθοδο ELISA. To πάχος του έσω και μέσω χιτώνα της κοιλιακής αορτής μετρήθηκε με συσκευή υπερήχων Mindray DC-8 expert (Shenzhen, P. R. China), με γραμμικό ηχοβολέα 3-12 Hz και αυτόματο σύστημα μέτρησης ΙΜΤ. H υπερηχογραφική μέτρηση του ΙΜΤ της κοιλιακής αορτής έγινε 2 φορές σε ένα ευθύ, μη διακλαδισμένο τμήμα της κοιλιακής αορτής κάτωθεν των νεφρικών αρτηριών και ύπερθεν του διχασμού σε λαγόνιες αρτηρίες, σύμφωνα με τα κριτήρια του Mannheim για τη μέτρηση ΙΜΤ καρωτίδας. Αποτελέσματα: Στην παρούσα μελέτη δε βρέθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά σωματικού βάρους ή ΒΜΙ στους ασθενείς (έγκυες με ΣΔΚ) και τους μάρτυρες (έγκυες χωρίς ΣΔΚ) αλλά ούτε και στατιστικά σημαντική διαφορά βάρους γέννησης στα νεογνά των 2 ομάδων.Ο aIMT ελέγχθηκε αυξημένος στα νεογνά μητέρων με ΣΔΚ (ασθενείς: median [range]=0.39 mm [0.31-0.46] vs μάρτυρες: median=0.28 mm [0.23-0.33]; p=0.001) και η διαφορά παρέμεινε στατιστικά σημαντική και μετά τη διόρθωση ως προς διάφορους συγχυτικούς παράγοντες (πχ τριγλυκερίδια, vitD, αρτηριακή πίεση, βάρος γέννησης και φύλο νεογνού). Οι ασθενείς (νεογνά εγκύων με ΣΔΚ) παρουσίασαν υψηλότερες τιμές ΙΜΤ κατά 0.13 σε σχέση με τους μάρτυρες (95% CI: 0.001-0.261 p=0.049). Η μέτρηση του aIMT δε διέφερε στατιστικά σημαντικά ανάμεσα στους ασθενείς ανάλογα με τον τρόπο θεραπείας ( ασθενείς που αντιμετωπίστηκαν με ινσουλίνη σε σχέση με τους ασθενείς που αντιμετωπίστηκαν μόνο με δίαιτα).Τα επίπεδα του TXNIP στον πλακούντα συνολικά, όπως αυτά μετρήθηκαν με τη μέθοδο ανοσοϊστοχημείας και την καταγραφή του total -h score παρουσίασαν ισχυρή συσχέτιση με το ΣΔΚ (p=0.001). Ανάλογα με την κυτταρική διαφοροποίηση, τα επίπεδα του TXNIP βρέθηκαν αυξημένα στους τροφοβλάστες (p=0.001) και τους συγκυτιοτροφοβλάστες (p=0.001) και μειωμένα στα ενδοθηλιακά κύτταρα (p=0.022) των πλακούντων εγκύων με ΣΔΚ σε σχέση με τους μάρτυρες. Επίσης βρέθηκε ότι τα επίπεδα του TXNIP στους τροφοβλάστες παρουσίασαν θετική συσχέτιση με το πάχους του aIMT (r=0.369; p=0.001). Τα επίπεδα του ΤΧΝΙΡ όπως μετρήθηκαν στον ορό ομφαλίου και νεογνικού αίματος με τη μέθοδο ELISA και στον πλακούντα με τη μέθοδο Western blot δεν παρουσίασαν στατιστικά σημαντική διαφοροποίηση μεταξύ ασθενών και μαρτύρων. Συμπεράσματα: Στη μελέτη μας διαπιστώσαμε αυξημένο πάχος aIMT στα νεογνά μητέρων με ΣΔΚ σε σχέση με τους μάρτυρες. Η μέτρηση του IMT της κοιλιακής αορτής ως μη επεμβατικού μέσου μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ένας βιοδείκτης ώστε να αναγνωρίζονται τα παιδιά με αυξημένο κίνδυνο για αθηρογένεση στη μετέπειτα ζωή. Ο ΤΧΝΙΡ μπορεί να συσχετίζεται με τον ΣΔΚ ή/και το aIMT ωστόσο είναι απαραίτητες περισσότερες μελέτες ώστε να ελεγχθεί αυτή η συσχέτιση. Η πρώιμη ανίχνευση του ευαίσθητου πληθυσμού είναι σημαντική για τη δυνατότητα πρώιμης παρέμβασης σε επίπεδο πρόληψης .Ο πληθυσμός παιδιών που βρίσκεται σε αυξημένο κίνδυνο χρήζει τακτικής παιδιατρικής για πιθανές διαιτητικές παρεμβάσεις και υιοθέτηση πρακτικών υγιεινού τρόπου ζωής. Παράλληλα έχουν ήδη γίνει κάποιες μελέτες που συσχετίζουν τη χρήση συμπληρωμάτων διατροφής- πχ αντιοξειδωτικά όπως κερσετίνη και κουρκουμίνη αλλά και φαρμακευτική θεραπεία με μείωση του οξειδωτικού στρες όπως αυτό φαίνεται από τη μείωση των επιπέδων του TXNIP.