The effect of tobacco smoke carcinogens on microRNA and mismatch repair expression profiles: a patient-based study and a mechanistic approach

Abstract

The main role of the DNA repair mechanism is to protect genetic material from destabilization. The loss or a low expression of DNA mismatch repair (MMR) can lead to the accumulation of a significant number of genetic alterations, including some in protooncogenes or genes regulating the cell cycle. The dysregulation of MMR gene expression and specific small regulatory molecules, like miRNAs, has been previously described in upper and lower aerodigestive tract malignancies, such as lung and head and neck cancer. Although tobacco smoking is a known risk factor that has been associated with the development and progression of upper aerodigestive tract malignancies, the exact mechanism by which tobacco smoke components promote defects in the DNA MMR mechanism associated with upper aerodigestive tract cancers remains unclear. The aim of this thesis was to investigate whether exposure to Tobacco Smoke Components (TSC), such as N-nitrosamines, can alter the MMR gene expression in squamous cancer cells of the upper and lower aerodigestive tract and identify the role of specific miRNA deregulation in this process. This investigation showed that the in vitro exposure of human lung and head and neck cancer cell lines (NCI and FaDu, respectively) to tobacco-specific nitrosamine 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) could alter the expression of MSH2 and MLH1, key MMR components, by promoting specific miRNA deregulation. The same in vitro model revealed that either low (1 μM) or high (2 μM) dose of NNK induced significant upregulation of “oncomirs” miR-21 and miR-155 and downregulation of “tumor suppressor” miR-422a, as well as the reduction of MMR protein and mRNA expression, in Squamous Cell Carcinoma (SCC) cells, compared to controls, promoting cancer cell progression. This model also showed that inhibition of miR-21 restored the NNK-related, reduced MSH2 phenotype in both NCI and FaDu, suggesting that miR-21 might contribute to MSH2 regulation. The data from in vivo experiments documented for the first time that the chronic exposure (12–14 weeks) of murine (C57Bl/6J) hypopharyngeal epithelium to TSC [N-nitrosamines; 4-(N-Methyl-N-Nitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (0.2 mmol/L), N-nitrosodiethylamine (0.004 mmol/L), with or without nicotine (0.02 μmol/L)], can induce premalignant lesions. Molecular analysis of the lesion revealed activation of NF-κB and its associated oncogenic pathways, as well as by dysregulation of specific miRNA and MMR genes, similar to the in vitro data. Specifically, dysplastic lesions caused by TSC exposure demonstrated a significant downregulation of MSH2 and MLH1 gene expression and deregulation of oncomirs miR-21, miR-155, tumor suppressor miR-34a, and miR-451a. Analysis of human specimens from tobacco smokers and their corresponding controls provided a significant reduction in hMSH2 and hMLH1 mRNAs in hypopharyngeal squamous cell carcinoma (HSCC) that had previously showed significant deregulation of specific miRNA markers, such as miR-21, miR-155 miR-34a, and miR-451a. In summary, deregulation of the MMR mechanism and miRNAs is caused by chronic exposure to TS-related N-Nitrosamines with or without nicotine in the early stages of upper aerodigestive tract carcinogenesis and can also be detected in human HSCC. Deregulated miR-21, miR-155, and miR-422a and MMR gene expression patterns may be valuable biomarkers for lung and head and neck squamous cell cancer progression in smokers. The data of this thesis contributed to a better understanding of the biological role of MMR genes in the development and progression of these types of cancer and provided the foundation for their future use in diagnostic, prognostic, and therapeutic approaches of upper aerodigestive malignancies.

Ο ρόλος του μηχανισμού επιδιόρθωσης του DNA είναι να προστατεύει το γενετικό υλικό από λάθη κατά την αντιγραφή του ή από βλάβες που οδηγούν σε ελαττωματικό επιδιορθωτικό μηχανισμό του DNA, οι οποίες μπορεί να συντελέσουν στην αποσταθεροποίησή του. Συγκεκριμένα, όταν υπάρχει απώλεια ή χαμηλή έκφραση των γονιδίων επιδιόρθωσης λάθους ζευγαρώματος του DNA (DNA Mismatch Repair or MMR), είναι δυνατόν να επιτραπεί η επιβίωση και ο πολλαπλασιασμός κυττάρων που φέρουν σημαντικό αριθμό γενετικών αλλοιώσεων, συμπεριλαμβανομένων πρωτο-ογκογονιδίων ή γονιδίων που ρυθμίζουν τον κυτταρικό κύκλο. Η απορρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων MMR, hMSH2 ή hMLH1, έχει συσχετιστεί με επιθετικούς καρκίνους του ανώτερου πεπτικού και αναπνευστικού συστήματος. Επίσης έχει αναφερθεί πιθανή αλληλεπίδραση μεταξύ συγκεκριμένων ρυθμιστικών μορίων, όπως τα μικρά μη-κωδικοποιά μόρια RNA, miRNA, και των γονιδίων MMR. Το κάπνισμα είναι ένας κοινός παράγοντας κινδύνου για τον καρκίνο του πνεύμονα και τον καρκίνο της κεφαλής και τραχήλου. Μοριακές αλλαγές όπως η απορρύθμιση της έκφρασης ειδικών miRNA έχει συσχετιστεί με το κάπνισμα και στους δύο τύπους καρκίνου. Ωστόσο, οι μηχανισμοί μέσω των οποίων τα συστατικά του καπνού του τσιγάρου, όπως οι Ν-νιτροζαμίνες, μπορεί να προάγουν έναν ελαττωματικό μηχανισμό επιδιόρθωσης λάθους ζευγαρώματος του DNA, MMR, συμπεριλαμβάνοντας την απορρύθμιση της έκφρασής των γονιδίων αναγνώρισης βλαβών, hMSH2, και επιδιόρθωσης, hMLH1, που σχετίζονται με καρκίνους του ανώτερου αναπνευστικού και πεπτικού συστήματος, παραμένουν ασαφείς. Στόχος αυτής της διατριβής ήταν να διερευνήσει εάν η έκθεση σε συστατικά του καπνού του τσιγάρου, όπως οι Ν-νιτροζαμίνες, μπορεί να αλλάξει την έκφραση των γονιδίων hMSH2 και hMLH1, βασικών συστατικών του μηχανισμού επιδιόρθωσης MMR, σε πλακώδη καρκινικά κύτταρα της ανώτερης αναπνευστικής και πεπτικής οδού, καθώς και ο ρόλος της απορρύθμισης της έκφρασης ειδικών miRNA σε αυτή τη διαδικασία. Η in vitro έκθεση ανθρώπινων κυτταρικών σειρών καρκίνου του πνεύμονα και της κεφαλής και του τραχήλου (NCI και FaDu, αντίστοιχα) σε νιτροζαμίνες συστατικών του καπνού, 4-(μεθυλνιτροζαμινο)-1-(3- πυριδυλ)-1-βουτανόνη (NNK), αποκάλυψε ότι μπορεί να απορυθμίζει την έκφραση των hMSH2 και hMLH1, διαμέσου της απορρύθμιση ειδικών miRNA. Τόσο η χαμηλή (1 μΜ) όσο και η υψηλή (2 μΜ) δόση NNK προκάλεσε σημαντική αύξηση της έκφρασης των miR-21 και miR-155, με γνωστό ογκογόνο ρόλο («oncomirs»), και μείωση της έκφρασης του «ογκοκατασταλτικού» miR-422a, καθώς και μείωση των μεταγραφικών (mRNA) αλλά και των πρωτεϊνικών επιπέδων έκφρασης των MMR πρωτεϊνών σε κύτταρα SCC, σε σύγκριση με μάρτυρες. Επίσης, τόσο η χαμηλή (1 μΜ) όσο και η υψηλή (2 μΜ) δόση NNK προκάλεσε την αύξηση του πληθυσμού των καρκινικών κυττάρων. Η αναστολή της έκφρασης του miR-21 αποκατέστησε την επαγόμενη από το NNK μειωμένη έκφραση του MSH2 τόσο στα NCI όσο και στα FaDu, υποδεικνύοντας ότι το miR-21 μπορεί να συμβάλει στη ρύθμιση του MSH2. Χρόνια έκθεση in vivo (12-14 εβδομάδες) του υποφαρυγγικού επιθηλίου ποντικού (C57Bl/6J) σε συστατικά καπνού τσιγάρου (TSC) [Ν-νιτροζαμίνες; 4- (Ν-μεθυλ-Ν-νιτροζαμινο) -1- (3-πυριδυλ)-1- βουτανόνη (0,2 mmol / L), Ν-νιτροζοδιαιθυλαμίνη (0,004 mmol / L), με ή χωρίς νικοτίνη (0,02 μmol / L )], 5 ημέρες την εβδομάδα, παρείχε άμεσες ενδείξεις προκαρκινικών βλαβών που προκαλούνται από τα συστατικά του καπνού. Στις προκαρκινικές αυτές βλάβες, παρατηρήθηκε ενίσχυση της ενεργοποίησης του μεταγραφικού παράγοντα NF-κB, που σχετίζεται με ογκογόνα σηματοδοτικά μονοπάτια, καθώς και από απορυθμισμένο μηχανισμό MMR και απορρύθμιση ειδικών miRNA. Στις δυσπλαστικές αλλοιώσεις που προκαλούνται από συστατικά του καπνού παρατηρήθηκε σημαντική μείωση στην έκφραση των γονιδίων MSH2 και MLH1 και απορρύθμιση έκφρασης των ογκονόνων miR-21, miR-155 και ογκοκατασταλτικών miR-34a και miR-451a. Η ανάλυση ανθρώπινων δειγμάτων από όγκους καπνιστών καπνού σε σχέση με τους παρακείμενους σε αυτούς φυσιολογικούς ιστούς, παρείχε κλινικές ενδείξεις σημαντικής μείωσης των hMSH2 και hMLH1 mRNA στο υποφαρυγγικό καρκίνωμα πλακώδους κυττάρου (HSCC) με ταυτόχρονη σημαντική απορρύθμιση των miR-21, miR-155 miR-34a και miR- 451α. Συνοπτικά, η χρόνια έκθεση του επιθηλίου της ανώτερης αναπνευστικής και πεπτικής οδού σε Ν-νιτροζαμίνες που σχετίζονται με τον καπνό του τσιγάρου, με ή χωρίς νικοτίνη, προκαλεί απορρύθμιση του μηχανισμού MMR και ειδικών miRNA προκαλείται στα πρώιμα στάδια της καρκινογένεσης στον πνεύμονα, στην κεφαλκη και στον τράχηλο. Τα απορυθμισμένα πρότυπα έκφρασης των γονιδίων miR-21, miR-155 και miR-422a και MMR μπορεί να είναι πολύτιμοι βιοδείκτες για την εξέλιξη του ακανθοκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα και της κεφαλής και του τραχήλου στους καπνιστές. Τα δεδομένα αυτής της διατριβής συμβάλλουν στην καλύτερη κατανόηση του βιολογικού ρόλου των γονιδίων MMR στην ανάπτυξη και εξέλιξη αυτών των τύπων καρκίνου, και επομένως μπορεί να βελτιώσουν τη διαγνωστική, προγνωστική και θεραπευτική τους αξία.