Modulation of important non-coding RNAs and proteins in cancer with role in transcription and translation initiation regulation

Abstract

Cancer progression involves the deregulation of several oncogenes and tumor suppressor genes, many of which participate directly or indirectly in signaling events that ultimately promote proliferation and survival. Two of the most commonly affected signaling pathways are the MAPK cascade and the PI3K/AKT/mTOR pathway. Both affect more than 200 downstream effectors and modulate almost every process of the cell, including transcription and translation. Transcription of coding RNAs by RNA pol II and non-coding RNAs by all three RNA polymerases leads, among others, to rewiring of protein synthesis. Eukaryotic translation has been considered one of the most energy consuming processes of the cells and, thus, it is tightly regulated. In order for a cell to become tumorigenic, translation reprogramming is necessary and is facilitated by complex regulatory networks that are mainly regulated by signaling pathways. Two of the most common oncogenes mutated in cancer are KRAS and BRAF, both of which regulate the MAPK cascade and the PI3K/AKT/mTOR signaling pathways. KRAS mutations are prevalent across numerous tumor types, including lung adenocarcinoma, which stands as one of the most frequently diagnosed cancers, often associated with unfavorable prognostic outcomes and limited efficacy of therapeutic interventions. Mutations in the BRAF gene primarily occur in melanoma but are also present in various other cancer types. Despite the availability of targeted treatments, melanoma cells rapidly develop resistance to BRAF inhibitors. These mutations can influence both transcription and translation processes, underscoring the need for a deeper understanding of their deregulation. To decipher the effects of KRASG12C on transcription and translation initiation in lung adenocarcinoma, generation of TetON-inducible KRASG12C stable A549 and CL1-5 cell lines using TALENs was performed. Further examination of the two cell lines revealed that in CL1-5 cells, cap-dependent translation was disrupted through the possible involvement of mTORC2 and NF-κB pathways. On the other hand, in A549 cells, cap-dependent translation was promoted through the activation of mTORC1, c-MYC, and the upregulation of the eIF4F complex. A decrease in the levels of eIF1, eIF5, and eIF5B in A549 cells indicated reduced fidelity in the initiation of protein synthesis. Puromycin staining and polysome profiling confirmed the increased translation activity in A549 cells compared to the compromised cap-dependent translation in CL1-5 cells. Notably, CL1-5 cells were able to recover their translation efficiency after extended activation of KRASG12C, but this recovery occurred via a route that did not involve mTORC1 or p70S6K. The expression profiles of specific tRNAs and tRFs also indicated variations in global protein synthesis rates. Finally, several mitochondrial tRFs were found modulated and correlated with deregulation of mitochondrial functions. In conclusion, in the first part of the present thesis, a divergent response is indicated among two epithelial-derived NSCLC cell lines upon induction of the same KRAS mutant, which affects the rewiring of protein synthesis, tRNA fragmentation and possibly mitochondrial integrity. At the second part of the present thesis, A375 and SKMEL5 melanoma cell lines resistant to vemurafenib (referred to as VR cell lines) were generated, and their IC50 values were determined. The development of resistance to vemurafenib resulted in a significant 10-fold increase in the IC50 of the A375VR and SKMEL5VR cell lines. These resistant cell lines exhibited continual activation of the MAPK pathway, even when exposed to high concentrations of vemurafenib. The mTOR kinase and its downstream substrates, S6K and 4EBPs, were differentially affected in the two VR cell lines, indicating differential effects on the signaling towards translation. The 60S/40S ratio indicated impaired ribosome biogenesis, which was correlated with the differential expression levels of the translation factor eIF6, suggesting its possible involvement in the acquired resistance to vemurafenib. To further investigate this, five melanoma cell lines (A375, SKMEL5, M1, M2 and M3) were edited to stably overexpress eIF6. These cells were analysed for changes in cell viability, proliferation rates, and migration, showing differential effects, possibly due to the different genomic context of each cell line. The response of the eFI6-overexpressing cells to vemurafenib was affected, with SKMEL5, M1 and M3 becoming more sensitive to BRAF inhibition, M2 cells more resistant, while A375 cells’ response remained unaffected. Higher 60S/40S ratios were observed in all cases, while key signaling effectors were differentially affected. The resistant eIF6-overexpressing M2 cells were correlated with lower phosphorylation levels of ERK1/2 kinase and higher total mTOR levels, while the opposite effects were observed in the sensitive eIF6-overexpressing SKMEL5, M1 and M3 cells. Taken together, the current thesis attempted to provide a comprehensive picture of the translation deregulation events governed by KRAS and BRAF mutants in lung adenocarcinoma and melanoma, respectively. The results show that KRASG12C can either promote or impair cap-dependent translation in two different lung adenocarcinoma cell lines. Finally, the present thesis further strengthens the significance of translation deregulation due to acquired resistance to vemurafenib in melanoma.

Η εξέλιξη του καρκίνου περιλαμβάνει την απορρύθμιση πολλών ογκογονιδίων και ογκοκατασταλτικών γονιδίων, πολλά από τα οποία συμμετέχουν άμεσα ή έμμεσα σε σηματοδοτικά γεγονότα που τελικά προάγουν τον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση. Δύο από τα πιο συχνά επηρεαζόμενα μονοπάτια σηματοδότησης είναι ο καταρράκτης MAPK και το μονοπάτι PI3K/AKT/mTOR. Και τα δύο επηρεάζουν περισσότερους από 200 μεταγενέστερους τελεστές και ρυθμίζουν σχεδόν κάθε διαδικασία του κυττάρου, συμπεριλαμβανομένης της μεταγραφής και της μετάφρασης. Η μεταγραφή των κωδικών RNAs από την RNA pol II και των μη κωδικών RNAs από τις τρεις RNA πολυμεράσες οδηγεί, μεταξύ άλλων, στην τροποποίηση της πρωτεϊνοσύνθεσης. Προκειμένου ένα κύτταρο να γίνει καρκινικό, ο επαναπρογραμματισμός της μετάφρασης είναι απαραίτητος και διευκολύνεται από πολύπλοκα ρυθμιστικά δίκτυα που ρυθμίζονται κυρίως από σηματοδοτικά μονοπάτια. Δύο από τα πιο κοινά ογκογονίδια που μεταλλάσσονται στον καρκίνο είναι τα KRAS και BRAF, τα οποία ρυθμίζουν τον καταρράκτη MAPK και το σηματοδοτικό μονοπάτι PI3K/AKT/mTOR. Οι μεταλλάξεις KRAS είναι διαδεδομένες σε πολυάριθμους τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα, το οποίο αποτελεί έναν από τους συχνότερα διαγνωσμένους καρκίνους, ο οποίος συχνά συνδέεται με δυσμενή προγνωστικά αποτελέσματα και περιορισμένη αποτελεσματικότητα των θεραπευτικών παρεμβάσεων. Οι μεταλλάξεις στο γονίδιο BRAF εμφανίζονται κυρίως στο μελάνωμα, αλλά είναι επίσης παρούσες σε διάφορους άλλους τύπους καρκίνου. Παρά τη διαθεσιμότητα στοχευουσών θεραπειών, τα κύτταρα του μελανώματος αναπτύσσουν ταχέως αντίσταση στους αναστολείς του BRAF. Αυτές οι μεταλλάξεις μπορούν να επηρεάσουν τόσο τις διαδικασίες μεταγραφής όσο και τις διαδικασίες μετάφρασης, υπογραμμίζοντας την ανάγκη για βαθύτερη κατανόηση της απορρύθμισής τους. Για την αποκρυπτογράφηση των επιδράσεων του KRASG12C στην έναρξη της μεταγραφής και της μετάφρασης στο αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα, πραγματοποιήθηκε η δημιουργία σταθερών κυτταρικών σειρών A549 και CL1-5 με επαγώγιμη έκφραση του KRASG12C μέσω TetON συστήματος με τη χρήση TALENs. Περαιτέρω εξέταση των δύο κυτταρικών σειρών αποκάλυψε ότι στα κύτταρα CL1-5, η εξαρτώμενη από την καλύπτρα μετάφραση διαταράχθηκε μέσω της πιθανής εμπλοκής των μονοπατιών mTORC2 και NF-κΒ. Από την άλλη πλευρά, στα κύτταρα A549, η εξαρτώμενη από την καλύπτρα μετάφραση προωθήθηκε μέσω της ενεργοποίησης του mTORC1, του c-MYC και της θετικής ρύθμισης του συμπλόκου eIF4F. Η μείωση των επιπέδων των eIF1, eIF5 και eIF5B στα κύτταρα A549 υποδεικνύει μειωμένη πιστότητα στην έναρξη της πρωτεϊνοσύνθεσης. Η χρώση με πουρομυκίνη και ο έλεγχος του προφίλ πολυσωμάτων επιβεβαίωσαν την αυξημένη μεταφραστική δραστηριότητα στα κύτταρα A549 σε σύγκριση με τη μειωμένη εξαρτώμενη από την καλύπτρα μετάφραση στα κύτταρα CL1-5. Αξίζει να σημειωθεί ότι τα κύτταρα CL1-5 ήταν σε θέση να ανακτήσουν τη μεταφραστική τους αποτελεσματικότητα μετά από παρατεταμένη ενεργοποίηση του KRASG12C, αλλά η ανάκτηση αυτή πραγματοποιήθηκε μέσω μιας οδού που δεν περιλάμβανε το mTORC1 ή την p70S6K. Τα προφίλ έκφρασης συγκεκριμένων tRNAs και tRFs έδειξαν επίσης διακυμάνσεις στους συνολικούς ρυθμούς πρωτεϊνοσύνθεσης. Τέλος, διαπιστώθηκε ότι αρκετά μιτοχονδριακά tRFs διαμορφώθηκαν και συσχετίστηκαν με την απορρύθμιση των μιτοχονδριακών λειτουργιών. Συμπερασματικά, στο πρώτο μέρος της παρούσας διατριβής, υποδεικνύεται μια αποκλίνουσα απόκριση μεταξύ δύο κυτταρικών σειρών αδενοκαρκινώματος πνεύμονα επιθηλιακής προέλευσης κατά την επαγωγή της ίδιας μετάλλαξης KRAS, η οποία επηρεάζει τη ρύθμιση της πρωτεϊνοσύνθεσης, την παραγωγή tRFs και ενδεχομένως την ακεραιότητα των μιτοχονδρίων.Στο δεύτερο μέρος της παρούσας διατριβής δημιουργήθηκαν κυτταρικές σειρές μελανώματος A375 και SKMEL5 ανθεκτικές στη βεμουραφενίμπη (αναφέρονται ως κυτταρικές σειρές VR) και προσδιορίστηκαν οι τιμές IC50 τους. Η ανάπτυξη ανθεκτικότητας στη βεμουραφενίμπη είχε ως αποτέλεσμα τη σημαντική 10πλάσια αύξηση της IC50 των κυτταρικών σειρών A375VR και SKMEL5VR. Αυτές οι ανθεκτικές κυτταρικές σειρές παρουσίασαν συνεχή ενεργοποίηση της οδού MAPK, ακόμη και όταν εκτέθηκαν σε υψηλές συγκεντρώσεις βεμουραφενίμπης. Η κινάση mTOR και τα κατώτερα υποστρώματά της, S6K και 4EBPs, επηρεάστηκαν διαφορετικά στις δύο κυτταρικές σειρές VR, υποδεικνύοντας διαφορετικές επιδράσεις στη σηματοδότηση προς τη μετάφραση. Η αναλογία 60S/40S υποδήλωσε διαταραγμένη βιογένεση των ριβοσωμάτων, η οποία συσχετίστηκε με τα διαφορετικά επίπεδα έκφρασης του μεταφραστικού παράγοντα eIF6, υποδηλώνοντας την πιθανή εμπλοκή του στην επίκτητη αντίσταση στη βεμουραφενίμπη. Για την περαιτέρω διερεύνηση αυτού, πέντε κυτταρικές σειρές μελανώματος (A375, SKMEL5, M1, M2 και M3) τροποποιήθηκαν ώστε να υπερεκφράζουν σταθερά τον eIF6. Τα κύτταρα αυτά αναλύθηκαν για αλλαγές στην κυτταρική βιωσιμότητα, τους ρυθμούς πολλαπλασιασμού και τη μετανάστευση, δείχνοντας διαφορετικές επιδράσεις, που πιθανώς οφείλονται στο διαφορετικό γονιδιωματικό πλαίσιο κάθε κυτταρικής σειράς. Η ανταπόκριση των κυττάρων που υπερεκφράζουν τον eFI6 στη βεμουραφενίμπη επηρεάστηκε, με τα κύτταρα SKMEL5, M1 και M3 να γίνονται πιο ευαίσθητα στην αναστολή του BRAF, τα κύτταρα M2 πιο ανθεκτικά, ενώ η ανταπόκριση των κυττάρων A375 παρέμεινε ανεπηρέαστη. Υψηλότερες αναλογίες 60S/40S παρατηρήθηκαν σε όλες τις περιπτώσεις, ενώ βασικοί σηματοδοτικοί τελεστές επηρεάστηκαν με διαφορετικό τρόπο. Τα ανθεκτικά κύτταρα Μ2 που υπερεκφράζουν τον eIF6 συσχετίστηκαν με χαμηλότερα επίπεδα φωσφορυλίωσης της κινάσης ERK1/2 και υψηλότερα συνολικά επίπεδα mTOR, ενώ τα αντίθετα αποτελέσματα παρατηρήθηκαν στα ευαίσθητα κύτταρα SKMEL5, Μ1 και Μ3 που υπερεκφράζουν τον eIF6. Συνολικά, η παρούσα διατριβή προσπάθησε να παράσχει μια ολοκληρωμένη εικόνα των γεγονότων απορρύθμισης της μετάφρασης που διέπονται από τις μεταλλάξεις KRAS και BRAF στο αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα και το μελάνωμα, αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το KRASG12C μπορεί είτε να προάγει είτε να εξασθενεί την εξαρτώμενη από την καλύπτρα μετάφραση σε δύο διαφορετικές κυτταρικές σειρές αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα. Τέλος, η παρούσα διατριβή ενισχύει περαιτέρω τη σημασία της απορρύθμισης της μετάφρασης λόγω της επίκτητης αντοχής στη βεμουραφενίμπη στο μελάνωμα.