Ανάπτυξη νέων βιο-λειτουργικών τροφίμων και βελτίωση της ολικής ποιότητας παραδοσιακών προϊόντων με κατάλληλη διαχείριση της μικροβιακής τους οικολογίας

Abstract

Lactic acid bacteria (LAB) are the dominant microflora and contribute positively to the technological, organoleptic (appearance, aroma, taste and texture) and beneficial characteristics of fermented food products. In the production of fermented foods, in addition to starter cultures, there is also the non- starter lactic acid bacteria culture (NSLAB). NSLAB are usually derived from the raw material, the production and processing environment and are called autochthonous microorganisms. NSLAB usually include microorganisms belonging to the species Lacticaseibacillus paracasei, Lacticaseibacillus casei and Lacticaseibacillus rhamnosus. Their use, in the production of fermented foods, can make a positive contribution to fermentation, improving the quality and safety of the final product. The aim of this thesis was to isolate autochthonous lactic acid bacteria from traditional fresh Greek cheeses and to evaluate their biochemical, technological, and probiotic characteristics. This evaluation was aimed at developing new safety multifunctional cultures to be used in the production of fermented dairy products as additional cultures to improve quality, safety, and improvement organoleptic characteristics.109 strains were recovered from traditional fresh cheeses and evaluated in vitro for their gas production capacity, proteolytic, lipolytic and hemolytic activity, exopolysaccharide production capacity (EPS), enzyme activity, growth ability in 6.5% NaCl and at different pH and temperature conditions. Subsequently, 48 strains were further evaluated for their survival in simulated gastrointestinal tract conditions, ability to hydrolyze bile salts, resistance in the presence of antibiotics and antimicrobial activity against pathogenic microorganisms. Some isolates that showed favorable technological and functional characteristics (good survival rates in low pH and bile salts, ability to produce β-galactosidase, and EPS) were strains Lactococcus lactis SRX2, SRX3, SRX5 and SMX16, Lacticaseibacillus paracasei SRX10 and Lactiplantibacillus plantarum FRX7, FB1, while Leuconostoc mesenteroides strains FMX3 and Lc. lactis SMX2 showed antimicrobial activity in vitro against the pathogen Listeria monocytogenes.The 48 isolates were then tested in situ to evaluate the effect they may have on the quality and organoleptic characteristics of the fermented dairy products, as well as its survivability in them. The 48 isolates were used as adjunct cultures in the form of monocultures and co-cultures in yoghurt production. The yoghurt samples were subjected to microbiological, physicochemical, and molecular analyses during storage at 4°C. Isolates that evaluated with desirable organoleptic characteristics in yogurt as monocultures and co-cultures were selected for addition as adjunct culture in Feta production. Feta cheeses were produced with the commercial starter culture and the addition of 9 LAB strains (Lactococcus lactis SMX2 and SMX16, Levilactobacillus brevis SRX20, Lacticaseibacillus paracasei SRX10, Lactiplantibacillus plantarum FRX20 and FB1, Leuconostoc mesenteroides FMX3, FMX11 and FRX4, isolated from handmade Greek cheeses) in different combinations to produce 13 Feta samples (12 Feta samples with the adjunct LAB and the control). Feta cheese samples were subjected to microbiological and physicochemical analyses during ripening and to microbiological, physicochemical, molecular and organoleptic analyses during storage at 4 °C. The results showed that after preparation, the LAB population was approximately 9.0 log CFU/g in all samples, while during storage, the population decreased to 6.5-7.0 log CFU/g. Furthermore, the addition of selected strains, particularly Lc. paracasei SRX10, resulted in cheeses with desirable and distinct organoleptic characteristics. In addition, molecular analysis by RAPD-PCR (randomly amplified polymorphic PCR) confirmed that the multifunctional LAB strains were viable until the end of preservation. To test the antimicrobial activity exhibited by FMX3 and SMX2 strains in situ against the pathogenic microorganism Listeria monocytogenes, yoghurt and Feta cheese were prepared using these strains as adjunct cultures. Thus, yoghurt was prepared with the additional culture Ln. mesenteroides FMX3 (YF), yoghurt with the additional culture Lc. lactis SMX2 (YS), yoghurt with a mixture of the additional acidophilic cultures Ln. mesenteroides FMX3 and Lc. lactis SMX2 (YFS) and yoghurt-milk (YC). This was followed by artificial contamination of the milk with the pathogen L. monocytogenes at a population of 4.0 log CFU/g. After fermentation, the yoghurt samples were subjected to microbiological and physicochemical analyses during preservation at 4°C. The YFS sample showed the greatest reduction in pathogen population by 2.4 log CFU/g. The population of lactic bacteria, at time 0, was 8.5 log CFU/g and 9.0 ± 0, 3 log CFU/g for mesophilic lactococci and lactobacilli respectively, while at the end of maintenance the population was 8.2 log CFU/g and 8.6 log CFU/g for mesophilic lactococci and lactobacilli respectively. The pH values varied between 4,7 and 4,4 throughout the preservation period. In addition, Feta cheese manufactured with FMX3 and SMX2 (Feta L12) and control Feta cheese were artificially inoculated (4 log CFU/g) with Listeria monocytogenes (a cocktail of 4 acid or nonacid adapted strains). Feta cheese samples were subjected to microbiological and physicochemical analyses during ripening and to microbiological and physicochemical analyses during storage at 4°C. The results indicated that the L. monocytogenes pathogen population was absent after 60 days (end of ripening) and after 90 days in the supplementary culture and in the control, respectively. The initial population of mesophilic lactobacilli and lactococci in the FL12 and the control (day 1) was 8.5-9.2 log CFU/g, while the population of mesophilic lactobacilli decreased by 1.2-1.5 log CFU/g by the end of preservation (60 days), while the population of lactococci decreased by 1.0-1.9 log CFU/g in all cases.The strain Lc. paracasei SRX10 showed good technological and organoleptic characteristics, such as tolerance to simulated gastrointestinal conditions, biosynthetic of exopolysaccharides and none hemolytic activity and was used as an adjunct culture in the production of yoghurt and Feta cheese giving distinct organoleptic characteristics. Thus, the characteristics of the strain were investigated at genome level through whole genome sequencing (WGS) and comparative genomics. The genomic analysis showed that, the genome of the strain consists of one chromosome of 2.81 Mb length and GC content of 46.40%. Lc. paracasei SRX10 shows high sequence similarity (> 99%) with other Lc. paracasei strains isolated from dairy products. The presence of genes involved in the technological and functional traits of Lc. paracasei SRX10 was investigated using EggNOG, BlastKOALA and BLAST+ tools. Genes encoding proteins related to technological traits such as those of acid tolerance (e.g. atpA, atpB, atpC, atpD), proteolytic enzymes (e.g. pepN, pepX and pepC), proteins related to fatty acid biosynthesis (e.g, fabD, fabH, fabZ), exopolysaccharide biosynthesis (e.g. epsA, epsB and epsC), survival in the human gastrointestinal tract and vitamin B1 production. It is noteworthy that Lc. paracasei strain SRX10 does not contain acquired antibiotic resistance genes and does not encode infectious agents. The complete genomic analysis of Lc. paracasei SRX10 confirms its safe use as an adjunct culture in the production of various dairy products, contributing to the improvement of the overall quality and nutritional characteristics of the final product.

Τα οξυγαλακτικά βακτήρια αποτελούν την κυρίαρχη μικροχλωρίδα, η οποία έχει βρεθεί ότι συμβάλλει θετικά στα τεχνολογικά, οργανοληπτικά (εμφάνιση, άρωμα, γεύση και υφή) και ευεργετικά χαρακτηριστικά των ζυμούμενων τροφίμων. Στην παραγωγή ζυμούμενων τροφίμων εκτός από τις εναρκτήριες οξυγαλακτικές καλλιέργειες, υπάρχει και η μη εναρκτήρια καλλιέργεια οξυγαλακτικών βακτηρίων (NSLAB). Τα NSLAB προέρχονται συνήθως από την πρώτη ύλη, το περιβάλλον παραγωγής και επεξεργασίας, και ονομάζονται αυτόχθονοι μικροοργανισμοί. Στα NSLAB ανήκουν συνήθως μικροοργανισμοί που ανήκουν στα είδη Lacticaseibacillus paracasei, Lacticaseibacillus casei και Lacticaseibacillus rhamnosus. Η χρήση τους στη παραγωγή ζυμούμενων τροφίμων, μπορεί να συμβάλλει θετικά στη ζύμωση, βελτιώνοντας την ποιότητα και την ασφάλεια του τελικού προϊόντος. Ο σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η απομόνωση αυτόχθονων οξυγαλακτικών βακτηρίων από παραδοσιακά φρέσκα ελληνικά τυριά και η αξιολόγηση των βιοχημικών, τεχνολογικών και προβιοτικών χαρακτηριστικών τους. Η αξιολόγηση αυτή, είχε ως στόχο την ανάπτυξη νέων ασφαλών πολυλειτουργικών καλλιεργειών που θα χρησιμοποιηθούν στη παραγωγή ζυμούμενων γαλακτοκομικών προϊόντων ως επιπρόσθετες καλλιέργειες, με στόχο τη βελτίωση της ποιότητας, της ασφάλειας και την ενίσχυση των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών. Ως εκ τούτου, 109 απομονωμένα οξυγαλακτικά βακτήρια ανακτήθηκαν από παραδοσιακά φρέσκα τυριά και αξιολογήθηκαν in vitro ως προς την ικανότητα παραγωγής αερίου, την πρωτεολυτική, λιπολυτική και αιμολυτική δραστηριότητα τους, την ικανότητα παραγωγής εξωπολυσακχαριτών, την ενζυμική δραστηριότητα τους, την ικανότητα ανάπτυξης σε 6,5% NaCl και σε διαφορετικές συνθήκες pH και θερμοκρασίας. Στην συνέχεια, 48 επιλεγμένα στελέχη αξιολογήθηκαν περαιτέρω ως προς την επιβίωσή τους σε προσομοιωμένες συνθήκες γαστρεντερικού σωλήνα, την ικανότητα υδρόλυσης των χολικών αλάτων, την αντοχή τους παρουσία αντιβιοτικών και την αντιμικροβιακή δραστικότητα έναντι παθογόνων μικροοργανισμών. Απομονώσεις που παρουσίασαν ευνοϊκά τεχνολογικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά (καλά ποσοστά επιβίωσης σε χαμηλό pH και χολικά άλατα, ικανότητα παραγωγής β-γαλακτοσιδάσης, και EPS) ήταν τα στελέχη Lactococcus lactis SRX2, SRX3, SRX5 και SMX16, Lacticaseibacillus paracasei SRX10 και Lactiplantibacillus plantarum FRX7, FB1, ενώ τα στελέχη Leuconostoc mesenteroides FMX3 και Lc. lactis SMX2 έδειξαν αντιμικροβιακή δράση in vitro έναντι του παθογόνου μικροοργανισμού Listeria monocytogenes. Στην συνέχεια, οι 48 απομονώσεις ελέγχθηκαν in situ, προκειμένου να αξιολογηθεί η επίδραση που μπορεί να έχουν στην ποιότητα και στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά των ζυμούμενων γαλακτοκομικών προϊόντων, καθώς και η ικανότητα επιβίωσης του σε αυτά. Οι 48 απομονώσεις χρησιμοποιήθηκαν ως επιπρόσθετες καλλιέργειες με τη μορφή μονοκαλλιεργειών και συγκαλλιεργειών στην παραγωγή γιαουρτιού. Τα δείγματα γιαουρτιού υποβλήθηκαν σε μικροβιολογικές, φυσικοχημικές και μοριακές αναλύσεις κατά τη διάρκεια της συντήρησης των δειγμάτων στους 4 °C. Οι απομονώσεις που βαθμολογήθηκαν με επιθυμητά οργανοληπτικά χαρακτηριστικά στο γιαούρτι ως μονοκαλλιέργειες αλλά και ως συγκαλλιέργειες επιλέχθηκαν για την προσθήκη τους ως επιπρόσθετες καλλιέργειες στην παραγωγή Φέτας. Τα τυριά Φέτα παρήχθησαν με την εμπορική εναρκτήρια καλλιέργεια και την προσθήκη 9 στελεχών LAB (Lactococcus lactis SMX2 και SMX16, Levilactobacillus brevis SRX20, Lacticaseibacillus paracasei SRX10, Lactiplantibacillus plantarum FRX20 και FB1, Leuconostoc mesenteroides FMX3, FMX11 και FRX4, που απομονώθηκαν από χειροποίητα ελληνικά τυριά) σε διαφορετικούς συνδυασμούς για την παραγωγή 13 δειγμάτων Φέτας (12 δείγματα Φέτας με τις πρόσθετες απομονώσεις LAB και ένα δείγμα μάρτυρας). Τα δείγματα τυριού Φέτας υποβλήθηκαν σε μικροβιολογικές και φυσικοχημικές αναλύσεις κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης και με μικροβιολογικές, φυσικοχημικές, μοριακές και οργανοληπτικές αναλύσεις κατά την αποθήκευση στους 4 °C. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι μετά την παρασκευή, ο πληθυσμός των LAB ήταν περίπου 9,0 log CFU/g σε όλα τα δείγματα, ενώ κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης, ο πληθυσμός τους μειώθηκε σε 6,5 - 7,0 log CFU/g. Επιπλέον, η προσθήκη επιλεγμένων στελεχών, ιδίως του στελέχους Lc. paracasei SRX10, οδήγησε σε τυριά με επιθυμητά και διακριτά οργανοληπτικά χαρακτηριστικά. Επιπλέον, η μοριακή ανάλυση RAPD-PCR (randomly amplified polymorphic PCR) επιβεβαίωσε ότι τα πολυλειτουργικά στελέχη LAB ήταν βιώσιμα μέχρι το τέλος της συντήρησης. Προκειμένου να εξεταστεί in situ η αντιμικροβιακή δράση που εμφάνισαν τα στελέχη FMX3 και SMX2 έναντι του παθογόνου μικροοργανισμού L. monocytogenes, παρασκευάστηκε γιαούρτι και τυρί Φέτα με τη χρήση αυτών των στελεχών ως επιπρόσθετες καλλιέργειες. Παρασκευάστηκε γιαούρτι με την επιπρόσθετη καλλιέργεια Ln. mesenteroides FMX3 (YF), γιαούρτι με την επιπρόσθετη καλλιέργεια Lc. lactis SMX2 (YS), γιαούρτι με μείγμα των επιπρόσθετων οξυγαλακτικών καλλιεργειών Ln. mesenteroides FMX3 και Lc. lactis SMX2 (YFS) και γιαούρτι-μάρτυρας (YC). Ακολούθησε τεχνητή επιμόλυνση του γάλακτος με το παθογόνο L. monocytogenes σε πληθυσμό 4,0 log CFU/g. Μετά το πέρας της ζύμωσης, τα δείγματα υποβλήθηκαν σε μικροβιολογικές και φυσικοχημικές αναλύσεις κατά τη συντήρηση τους στους 4°C. Το δείγμα γιαουρτιού YFS εμφάνισε τη μεγαλύτερη μείωση στο πληθυσμό του παθογόνου κατά 2,4 log CFU/g. Ο πληθυσμός των γαλακτικών βακτηρίων, στο χρόνο 0, ήταν 8,5 log CFU/g και 9,0 log CFU/g για τους μεσόφιλους γαλακτόκοκκους και γαλακτοβακίλλους αντίστοιχα, ενώ στο τέλος της συντήρησης ο πληθυσμός ήταν 8,2 log CFU/g και 8,6 log CFU/g για τους μεσόφιλους γαλακτόκοκκους και γαλακτοβακίλλους αντίστοιχα. Οι τιμές pH διακυμάνθηκαν μεταξύ 4,7 με 4,4 καθόλα τη διάρκεια της συντήρησης. Στην περίπτωση του τυριού Φέτας, παρασκευάσθηκε Φέτα με την επιπρόσθετη συγκαλλιέργεια των στελεχών FMX3 και SMX2 (Φέτα L12), και ακολούθησε η τεχνητή επιμόλυνση των δειγμάτων (4,0 log CFU/g) με το παθογόνο L. monocytogenes (κοκτέιλ από 4 προσαρμοσμένα σε οξύ ή μη οξύ στελέχη). Τα δείγματα τυριού Φέτας υποβλήθηκαν σε μικροβιολογικές και φυσικοχημικές αναλύσεις κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης και με μικροβιολογικές και φυσικοχημικές αναλύσεις κατά την αποθήκευση τους στους 4 °C. Τα αποτελέσματα υπέδειξαν ότι ο πληθυσμός του παθογόνου L. monocytogenes απουσίαζε μετά από 60 ημέρες (τέλος της ωρίμανσης) και μετά από 90 ημέρες στη συμπληρωματική καλλιέργεια και στη Φέτα μάρτυρα, αντίστοιχα. Ο αρχικός πληθυσμός μεσόφιλων γαλακτοβακίλλων και γαλακτόκοκκων στη Φέτα L12 και στο δείγμα μάρτυρας (ημέρα 1) ήταν 8,5 - 9,2 log CFU/g, ενώ ο πληθυσμός των μεσόφιλων γαλακτοβακίλλων μειώθηκε κατά 1,2 - 1,5 log CFU/g μέχρι το τέλος της συντήρησης (60 ημέρες), ενώ ο πληθυσμός των γαλακτόκοκκων μειώθηκε κατά 1,0 - 1,9 log CFU/g σε όλες τις περιπτώσεις.Το στέλεχος Lc. paracasei SRX10, έδειξε ανοχή σε προσομοιωμένες γαστρεντερικές συνθήκες, βιοσυνθετική ικανότητα εξωπολυσακχαριτών, έλλειψη αιμολυτικής δραστηριότητας και κατά την παραγωγή γιαουρτιού και τυριού Φέτας προσέδωσε ξεχωριστά οργανοληπτικά χαρακτηριστικά. Για τους λόγους αυτούς δερευνήθηκαν τα χαρακτηριστικά του σε επίπεδο γονιδιώματος μέσω της αλληλούχισης ολόκληρου γονιδιώματος και της συγκριτικής γονιδιωματικής. Η γονιδιωματική ανάλυση έδειξε ότι, το γονιδίωμα του στελέχους αποτελείται από ένα χρωμόσωμα μήκους 2,81 Mb και περιεκτικότητα GC 46,40%. Tο στέλεχος Lc. paracasei SRX10 εμφανίζει υψηλή ομοιότητα σε επίπεδο αλληλουχίας (> 99%) με άλλα στελέχη του είδους Lc. paracasei που έχουν απομονωθεί από γαλακτοκομικά προϊόντα. Η παρουσία γονιδίων που εμπλέκονται στα τεχνολογικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά του Lc. paracasei SRX10 διερευνήθηκε με τη χρήση των εργαλείων EggNOG, BlastKOALA και BLAST+. Ταυτοποιήθηκαν γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες που σχετίζονται με τεχνολογικά χαρακτηριστικά, όπως αυτά της ανοχή σε όξινες συνθήκες (π.χ. atpA, atpB, atpC, atpD), πρωτεολυτικά ένζυμα (π.χ. pepN, pepX και pepC), πρωτεΐνες που σχετίζονται με τη βιοσύνθεση λιπαρών οξέων (π.χ., fabD, fabH, fabZ), τη βιοσύνθεση εξωπολυσακχαριτών (π.χ. epsA, epsB και epsC), την επιβίωση στον ανθρώπινο γαστρεντερικό σωλήνα και την παραγωγή Βιταμίνης Β1. Αξίζει να σημειωθεί ότι το στέλεχος Lc. paracasei SRX10 δεν περιέχει γονίδια επίκτητης ανθεκτικότητας στα αντιβιοτικά και δεν κωδικοποιεί λοιμογόνους παράγοντες. Η πλήρης γονιδιωματική ανάλυση του Lc. paracasei SRX10 επιβεβαιώνει την ασφαλή χρήση του ως επιπρόσθετη καλλιέργεια στην παραγωγή διαφόρων γαλακτοκομικών προϊόντων, συμβάλλοντας στη βελτίωση της συνολικής ποιότητας και των διατροφικών χαρακτηριστικών του τελικού προϊόντος.