Διερεύνηση της δραστικότητας δευτερογενών μεταβολιτών του είδους Olea europaea, έναντι πρωτοζώων του γένους Leishmania

Abstract

Plants have always been a valuable source for the discovery of molecules with pharmacological activity. Their numerous secondary metabolites possess a wide range of biological effects including antioxidant, anti-inflammatory, anticancer and antimicrobial activities. Among plants whose constituents have been extensively studied as pharmacological compounds, is the Olive tree (Olea europaea). A large number of experimental and clinical studies have demonstrated the capability of extra virgin olive oil to promote human health through the reduction of inflammatory and oxidative processes that lead to chronic diseases associated with inflammation and oxidation. These properties of extra virgin olive oil have placed it high in the hierarchy as “functional food” and numerous studies have been devoted to analyze the bioactivity of its compounds. It has been shown that the benefits of olive oil are attributed mainly to its phenolic fraction that includes a variety of more than 50 phenolic compounds. The Mediterranean region is an area that the olive tree flourishes and olive oil is an irreplaceable ingredient of the so-called Mediterranean diet that has been linked with indisputable benefits for the human health. In the Mediterranean region, leishmaniasis is an endemic disease, along with other tropical and sub-tropical regions worldwide, such as South America, Middle East and Central Asia, whose etiological agent is the protozoan parasites of the genus Leishmania spp. The parasite is transmitted through the bite of the intermediate host that is the phlebotomine sand fly. The main hosts of the parasite are humans, dogs and rodents, while dogs are the main domestic reservoirs. The outcome of the disease depends strongly on the host’s immune response, where a cellular immunity of the Th1 type is associated with control of the disease, whereas the Th2 type is associated with disease progression. Since a vaccine appropriate for human use does not exist, the battle against the disease relies on a limited number of chemotherapeutic drugs with various side effects, such as resistance and high toxicity. Consequently, the search for new antileishmanial molecules is mandatory in order to overcome the problems of the existing therapies and the field of natural products can be a promising source of new drugs. Following this pave of research, the aim of the present PhD thesis was to investigate the antileishmanial and immunomodulatory properties of the total phenolic fraction (TPF) of extra virgin olive oil and its pure molecule oleocanthal that is included in the total phenolic fraction, in in vitro and in vivo systems. TPF was found to be effective against two different species of Leishmania spp., L. infantum and L. major in its both developmental forms, promastigotes and amastigotes, and the half – maximal inhibitory concentration (IC50) was determined as a measure of its antileishmanial effectiveness. Moreover, in order to determine the mode of antileishmanial action of TPF, the study was focused on the investigation of the type of the induced cell death in the Leishmania spp. promastigotes upon their exposure to TPF by determining morphological features and biochemical markers of apoptosis. The morphological alterations were obtained by optical microscopy, and the data showed that TPF provoked cell shrinkage in Leishmania spp. promastigotes, while fluorescence microscopy pointed out significant damage of their DNA integrity. The study of the biochemical alterations revealed that TPF caused DNA fragmentation, disorder of the cytoplasmic membrane structure, disruption of the mitochondrial membrane potential (ΔΨm), and excessive ROS production. These findings indicated that TPF provoked apoptotic cell death in Leishmania spp. promastigotes. The aforementioned promising in vitro results prompted the extension of the study in an in vivo murine model of cutaneous leishmaniasis, in order to investigate the potential use of TPF as an antileishmanial drug. BALB/c mice were infected in the footpad with L. major promastigotes and were treated with TPF. The treatment with TPF caused reduction of the footpad swelling along with significant reduction in the parasitic load of the popliteal lymph nodes. Interestingly, TPF exerted an immunomodulatory effect in experimental mice by promoting the polarization of the immune response towards a protective regime and eventually the control of the disease. Clearly, the production of IgG1 and IgG2a antibody isotypes characterize the induction of a mixed Th1- and Th2-type immune response. However, the cytokine production of INF-γ and the gene expression of Tbx21 and GATA-3 transcription factors indicate a more prominent Th1- over Th2-type response. Qualitative and quantitative analysis of TPF, revealed that it was rich in the phenolic molecule oleocanthal. Consequently, the next goal of the study was to test the pure molecule of oleocanthal for its antileishmanial effect against the promastigotes and amastigotes of the same Leishmania species, in order to determine its antileishmanial effect. Oleocanthal is a molecule that gathers a lot of scientific attention because of its anti-inflammatory properties that are comparable to those of the non-steroidal anti-inflammatory drug ibuprofen. It also possesses antioxidant capacity and antimicrobial properties. The present study revealed the in vitro antileishmanial activity of oleocanthal, as well as its therapeutic effect in in vivo murine experimental models of cutaneous and visceral leishmaniasis. In the murine model of cutaneous leishmaniasis, BALB/c mice were infected with L. major promastigotes in the footpad and were treated with oleocanthal in two experimental doses. Oleocanthal in both doses reduced significantly both the skin lesions that were measured as footpad swelling and the parasitic load of the popliteal lymph nodes. Feet of the mice were submitted to histopathological analysis which revealed a topical immune response that leads to retrenchment of the infection and the recruitment of cells of the innate and adaptive immunity, such as macrophages, mast cells, T- and B-lymphocytes that are recruited in order to control the infection. Oleocanthal caused alterations in the IgG1 and IgG2a antibodies isotype production and the obtained profile indicated the dominance of a Th1 rather immune response. Moreover, analysis of the immune response induced by oleocanthal treatment demonstrated enhanced production of IL-12 cytokine and elevated gene expression ratios of Tbx21/GATA-3 and IL-12/IL-4 that suggest a polarization of the immune responses towards the Th1- type that is strongly associated with the resolution of the disease. In the murine model of visceral leishmaniasis, BALB/c mice were intravenously infected with L. infantum promastigotes and were treated with two doses of oleocanthal. Oleocanthal in both experimental doses caused the significant reduction of parasitic load in both spleen and liver which are the target organs of visceral leishmaniasis. It was also found that oleocanthal provoked elevation of the production of nitric oxide (NO), an important leishmanicidal molecule, in spleen cells. Despite the low parasitic load and the induction of NO, the IgG1 and IgG2a antibodies isotype production, the cytokines production (IL-12, IFN-γ and IL-4) and the gene expression of certain transcription factors (Tbx-21, GATA-3, STAT-1 and STAT-4), did not show a clear dominance of a Th1- over a Th2-type immune response. Overall, the results of this study suggest that TPF from extra virgin olive oil and its pure molecule oleocanthal, are able to act as antileishmanial and immunomodulatory agents. These promising data suggest that there is an open field for further research development on the phenols from extra virgin olive oil as potential drugs against infectious diseases and as immunomodulatory agents, that can be further exploited for the advantageous regulation of the host’s immunity, in order to confront serious health conditions.

Τα φυτά ανέκαθεν αποτελούσαν πολύτιμη πηγή μορίων με φαρμακολογικές ιδιότητες. Οι πολυάριθμοι δευτερογενείς μεταβολίτες που διαθέτουν παρουσιάζουν ένα μεγάλο εύρος βιολογικών δράσεων μεταξύ των οποίων περιλαμβάνονται αντιοξειδωτικές, αντιφλεγμονώδεις, αντικαρκινικές και αντιμικροβιακές ιδιότητες. Το δέντρο της ελιάς (Olea europaea) συγκαταλέγεται μεταξύ των φυτών που έχουν μελετηθεί εκτενώς για φαρμακολογικές δράσεις. Η ικανότητα του εξαιρετικού παρθένου ελαιολάδου να προωθεί την ανθρώπινη υγεία διαμέσου του περιορισμού της οξείδωσης και της φλεγμονής που μπορούν να οδηγήσουν σε χρόνια εκφυλιστικά νοσήματα, έχει δειχθεί από έναν μεγάλο αριθμό πειραματικών και κλινικών μελετών. Οι ιδιότητες αυτές του ελαιολάδου το καθιστούν ένα από τα σημαντικότερα λεγόμενα «λειτουργικά τρόφιμα» και πλήθος ερευνητικών εργασιών είναι αφιερωμένες στη διαλεύκανση της βιοδραστικότητας των συστατικών του. Οι ευεργετικές επιδράσεις του οφείλονται κυρίως στο φαινολικό κλάσμα του, το οποίο περιέχει πάνω από 50 διαφορετικά φαινολικά μόρια. Η λεκάνη της Μεσογείου είναι μια περιοχή όπου το δέντρο της ελιάς ευδοκιμεί και το ελαιόλαδο αποτελεί ένα αναντικατάστατο συστατικό της Μεσογειακής διατροφής, η οποία συνδέεται αδιαμφισβήτητα με οφέλη στην ανθρώπινη υγεία.H νόσος λεϊσμανίαση η οποία οφείλεται στα παράσιτα του γένους Leishmania spp. ενδημεί στην περιοχή της Μεσογείου, καθώς και σε άλλες τροπικές και υποτροπικές περιοχές του πλανήτη, όπως η Νότια Αμερική, η Μέση Ανατολή και η Κεντρική Ασία. Η μετάδοσή της πραγματοποιείται μέσω του δήγματος του ενδιάμεσου ξενιστή, της σκνίπας. Οι κυριότεροι τελικοί ξενιστές του παρασίτου είναι ο σκύλος που αποτελεί τη βασική δεξαμενή του παρασίτου, ο άνθρωπος, και τα τρωκτικά. Το αποτέλεσμα της λοίμωξης από το παράσιτο Leishmania spp. εξαρτάται κυρίως από την ανοσολογική ικανότητα που θα εκδηλώσει ο τελικός ξενιστής, καθώς η κυτταρική ανοσολογική απάντηση του Th1 τύπου σχετίζεται με την αντιμετώπιση του παρασίτου και την ίαση, ενώ η ανοσολογική απάντηση του Th2 τύπου σχετίζεται με την πρόοδο της νόσου. Καθώς δεν υπάρχει διαθέσιμο εμβόλιο για την πρόληψη της νόσου στον άνθρωπο, η αντιμετώπισή της βασίζεται σε έναν περιορισμένο αριθμό χημειοθεραπευτικών παραγόντων οι οποίοι εμφανίζουν σημαντικά μειονεκτήματα, όπως ανάπτυξη αντοχής του παρασίτου και τοξικότητα. Συνεπώς, η αναζήτηση νέων μορίων με αντιλεϊσμανιακή δράση είναι ουσιώδους σημασίας και το πεδίο των φυσικών προϊόντων μπορεί να αποτελέσει μια υποσχόμενη πηγή νέων φαρμάκων. Ακολουθώντας αυτό το ερευνητικό μονοπάτι, η παρούσα διδακτορική διατριβή είχε ως στόχο να διερευνήσει την αντιλεϊσμανιακή και ανοσοτροποιητική δράση του ολικού φαινολικού κλάσματος (Total Phenolic Fraction, TPF) του εξαιρετικού παρθένου ελαιολάδου και του προερχόμενου από αυτό καθαρού μορίου της ολεοκανθάλης, σε in vitro και in vivo συστήματα. Το TPF αποδείχτηκε δραστικό έναντι δύο διαφορετικών στελεχών του παρασίτου Leishmania spp., των L. infantum και L. major, τόσο στην προμαστιγωτή όσο και στην αμαστιγωτή μορφή τους, ενώ ως δείκτης της αποτελεσματικότητάς του προσδιορίστηκε η μέση ανασταλτική συγκέντρωση της επιβίωσης/πολλαπλασιασμού του παρασίτου (IC50). Επιπροσθέτως, η ερευνητική μελέτη επικεντρώθηκε στη διερεύνηση του τύπου του κυτταρικού θανάτου των προμαστιγωτών που επάγεται από τη δράση του TPF, μέσω του προσδιορισμού συγκεκριμένων μορφολογικών και βιοχημικών παραμέτρων που σχετίζονται με την απόπτωση.Οι μορφολογικές αλλαγές που παρατηρήθηκαν μέσω οπτικής μικροσκοπίας ανέδειξαν την ικανότητα του TPF να προκαλεί συρρίκνωση του κυτταρικού σώματος, ενώ η μικροσκοπία φθορισμού ανέδειξε σημαντικές βλάβες στην ακεραιότητα του DNA τους. Η μελέτη των βιοχημικών τροποποιήσεων αποκάλυψε ότι το TPF είναι ικανό να προκαλεί κατακερματισμό του DNA των προμαστιγωτών Leishmania spp., αποδιοργάνωση της κυτταροπλασματικής τους μεμβράνης, διαταραχή του μιτοχονδριακού διαμεμβρανικού δυναμικού (ΔΨm) και εκσεσημασμένη παραγωγή ROS. Τα παραπάνω ευρήματα υποδήλωσαν την ικανότητα του TPF να προκαλεί αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο στους προμαστιγώτες Leishmania spp. Η υποσχόμενη αντιλεϊσμανιακή δράση του TPF όπως αναδείχθηκε από τα in vitro αποτελέσματα, οδήγησε την παρούσα μελέτη στην επέκταση της έρευνας σε in vivo πειραματικό μοντέλο δερματικής λεϊσμανίασης ποντικών, με σκοπό να διερευνηθεί η δράση του ως δυνητικό αντιλεϊσμανιακό φάρμακο. Ποντίκια της αιμομικτικής φυλής BALB/c μολύνθηκαν στο πέλμα με L. major προμαστιγώτες και τους χορηγήθηκε ως θεραπεία TPF. Το TPF προκάλεσε μείωση του φλεγμονώδους οιδήματος στο σημείο της μόλυνσης και σημαντική μείωση του παρασιτικού φορτίου στους ιγνυακούς λεμφαδένες. Επιπλέον, το TPF επέδειξε ανοσοτροποποιητικές ιδιότητες προωθώντας την πόλωση της ανοσολογικής απόκρισης προς τον προστατευτικό τύπο της κυτταρομεσολαβητικής ανοσίας, επιτυγχάνοντας τον έλεγχο της νόσου. Ειδικότερα, διαπιστώθηκε η παραγωγή ειδικών αντιλεϊσμανιακών αντισωμάτων των IgG1 και IgG2a ισοτύπων, η οποία ήταν χαρακτηριστική της επαγωγής μικτής Th1 και Th2 απόκρισης με κυρίαρχο τον Th1 τύπο λεμφοκυττάρων. Αυτό επιβεβαιώθηκε από την αυξημένη παραγωγή της κυτταροκίνης IFN-γ, καθώς και από τη γονιδιακή έκφραση των μεταγραφικών παραγόντων Tbx21 και GATA-3, που υπέδειξαν υπερίσχυση της Th1- τύπου απόκρισης.Ποιοτική και ποσοτική ανάλυση του TPF αποκάλυψε ότι ήταν πλούσιο στο φαινολικό μόριο της ολεοκανθάλης. Συνεπώς, ως επόμενος στόχος της μελέτης τέθηκε η διερεύνηση των πιθανών αντιλεϊσμανιακών ιδιοτήτων του καθαρού μορίου της ολεοκανθάλης έναντι των προμαστιγωτών και αμαστιγωτών μορφών των προαναφερθέντων παρασιτικών στελεχών, προκειμένου να προσδιοριστεί η μονήρης βιοδραστικότητά του κατά των παρασίτων Leishmania spp. Η ολεοκανθάλη συγκεντρώνει σημαντικό επιστημονικό ενδιαφέρον εξαιτίας των ισχυρών αντιφλεγμονωδών δράσεών της, που είναι συγκρίσιμες με αυτές της ιβουπροφαίνης, ενός μη στεροειδούς αντιφλεγμονώδους φαρμάκου. Επιπλέον, ανάμεσα στις δράσεις της συγκαταλέγονται και αντιοξειδωτικές και αντιμικροβιακές ιδιότητες. Η παρούσα μελέτη απέδειξε μια υποσχόμενη in vitro αντιλεϊσμανιακή δράση της ολεοκανθάλης η οποία επιβεβαιώθηκε και σε in vivo πειραματικά μοντέλα δερματικής και σπλαγχνικής λεϊσμανίασης. Στο πειραματικό μοντέλο της δερματικής λεϊσμανίασης, ποντικοί της αιμομικτικής φυλής BALB/c μολύνθηκαν με L. major προμαστιγώτες στο πέλμα και στη συνέχεια τους χορηγήθηκε ολεοκανθάλη σε δύο πειραματικές δοσολογίες. Η θεραπεία με ολεοκανθάλη μείωσε τις υποκείμενες βλάβες στο σημείο της μόλυνσης οδηγώντας σε μειωμένο φλεγμονώδες οίδημα και ταυτόχρονα προκάλεσε σημαντική μείωση του παρασιτικού φορτίου στους ιγνυακούς λεμφαδένες. Επιπλέον, τα πέλματα των ποντικών υποβλήθηκαν σε ιστοπαθολογική μελέτη που ανέδειξε την εκδήλωση τοπικής ανοσολογικής απόκρισης η οποία οδηγεί στην περιχαράκωση της μόλυνσης και στη στρατολόγηση κυττάρων της έμφυτης και προσαρμοστικής ανοσίας, όπως μακροφάγων, μαστοκυττάρων, Β- και T-κυττάρων, τα οποία συμβάλλουν στον έλεγχο της λοίμωξης. Επίσης, η ολεοκανθάλη προκάλεσε μεταβολή της παραγωγής των ειδικών αντιλεϊσμανιακών αντισωμάτων των IgG1 και IgG2a ισοτύπων με τρόπο που υποδεικνύει την επικράτηση της προστατευτικής Th1-τύπου απόκρισης. Επιπρόσθετα, αναδείχθηκε η ενισχυμένη παραγωγή της κυτταροκίνης IL-12 και η ενίσχυση των λόγων της γονιδιακής έκφρασης Tbx21/GATA-3 και IL-12/IL-4, που σχετίζονται με την πόλωση της ανοσολογικής απόκρισης προς τον Th1-τύπο, οδηγώντας στην αντιμετώπιση της νόσου. Στο αντίστοιχο πειραματικό μοντέλο της σπλαγχνικής λεϊσμανίασης, ποντικοί της αιμομικτικής φυλής BALB/c μολύνθηκαν ενδοφλεβίως με L. infantum προμαστιγώτες και στη συνέχεια τους χορηγήθηκε ολεοκανθάλη σε δύο πειραματικές δοσολογίες. Η ολεοκανθάλη προκάλεσε σημαντική μείωση του παρασιτικού φορτίου στο σπλήνα και στο ήπαρ που αποτελούν τα όργανα-στόχους του παρασίτου στη σπλαγχνική λεϊσμανίαση. Επίσης, η θεραπεία με ολεοκανθάλη οδήγησε σε αυξημένη παραγωγή μονοξειδίου του αζώτου (NO) που αποτελεί βασικό λεϊσμανιοκτόνο μόριο. Ωστόσο, παρά τη μείωση στο παρασιτικό φορτίο και την επαγωγή του NO, η παραγωγή των αντισωμάτων IgG1 και IgG2a, η παραγωγή των κυτταροκινών (IL-12, IFN-γ και IL-4) και η γονιδιακή έκφραση συγκεκριμένων μεταγραφικών παραγόντων (Tbx-21, GATA-3, STAT-1 και STAT-4) δεν ανέδειξαν μια ξεκάθαρη επικράτηση της Th1-τύπου απόκρισης επί της Th2- τύπου.Εν κατακλείδι, τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής αναδεικνύουν ότι το TPF που προέρχεται από εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο, καθώς και το καθαρό μόριο της ολεοκανθάλης, έχουν την ικανότητα να δρουν ως αντιλεϊσμανιακοί και ανοσοτροποιητικοί φαρμακευτικοί παράγοντες. Αυτά τα υποσχόμενα επιστημονικά δεδομένα επισημαίνουν ότι υπάρχει ένα ανοιχτό πεδίο επιστημονικής έρευνας των φαινολών του εξαιρετικού παρθένου ελαιολάδου ως δυνητικών φαρμάκων έναντι λοιμωδών ασθενειών, καθώς και ως ανοσοτροποποιητικών παραγόντων που μπορούν να αξιοποιηθούν για τη ρύθμιση της ανοσίας προκειμένου να αντιμετωπιστούν σοβαρές ανθρώπινες ασθένειες.