Μελέτη μη κωδικών μορίων RNA (ncRNAs) σε καρκινικά κύτταρα και όγκους ωοθηκών

Abstract

Ovarian cancer (OC) is the second most frequently diagnosed and the most lethal gynecological malignancy in developed countries, accounting for approximately 5% of female cancer-related mortality worldwide. Even though early-diagnosis (FIGO I/II) has a 5-year survival up to 90%, most of the patients (~75%) are diagnosed in advanced disease stages (FIGO III/IV) with a 5-year survival of ~25%, the poorest among all gynecological malignancies. Early-diagnosis is proving difficult, while the significant progress in surgical techniques and targeted therapies has only modestly improved the relatively high death-to-incidence rate of patients diagnosed in advanced disease stages. Moreover, the high heterogeneity of tumors’ molecular background and patients’ treatment response hinders personalized prognosis and tailored therapies. Therefore, the identification of novel molecular markers could be a valuable tool to support personalized prognosis, benefit risk-stratification and therapeutic decisions, as well as to ameliorate the quality-of-life of the patients. In the present PhD thesis, recognizing the clinical need of identifying new molecular biomarkers in ovarian cancer, we aimed at studying the expression and evaluating the clinical significance of non-coding RNA (ncRNA) in cancer cell lines and ovarian tumors. According to the ENCODE project, more than 75% of the genome is actively transcribed in ncRNAs. Among them, microRNAs (miRNAs) have emerged as potent post-transcriptional regulators of gene expression. Moreover, it has been established that numerous miRNAs exert oncogenic or tumor-suppressive roles in ovarian cancer tumorigenesis and progression, thus representing promising molecular markers to support precision medicine. Additionally, tRNA-derived fragments (tRFs), initially thought to be random by-products of tRNA metabolism, constitute an abundant and evolutionarily conserved class of small non-coding RNAs with precise sequence and defined biological roles. Unsurprisingly, numerous research groups have identified tRFs as potential prognostic molecular markers in various cancer types. The evaluation of the clinical utility of miR-203 expression in the two institutionally-independent cohorts revealed an independent and unfavorable significance of miR-203 expression, concerning prognosis of epithelial ovarian cancer patients. In particular, miR-203 overexpression was significantly associated with worse survival outcome of patients, following tumor resection and first-line platinum-based chemotherapy compared to patients underexpressing miR-203, independently of FIGO stage, tumor grade, residual tumor size, chemotherapy response and age. Additionally, multivariate models incorporating miR-203 expression with the widely-used prognostic disease markers resulted in superior positive prediction of the patients at higher risk for poor treatment outcome, as well as in improved patients’ risk-stratification and clinical benefit of ovarian cancer prognosis. Furthermore, miR-181a assessment in the two institutionally-independent cohorts and three external publicly available datasets unveiled that miR-181a is associated with adverse clinicopathological characteristics of the patients and could promote patients’ personalized prognosis and improve the prediction of treatment outcome in serous ovarian cancer. More precisely, miR-181a overexpression was significantly correlated with a worse outcome of the patients following cytoreductive surgery and first-line platinum-based chemotherapy, compared to the patients expressing lower levels of miR-181a. Strikingly, miR-181a retained its independent prognostic value in multivariate prognosis model that included FIGO stage, tumor grade, residual tumor size and chemotherapy response. In the study design, the analysis of the two institutionally-independent cohorts, with a median follow-up time that exceeds five years, along with the three external publicly available datasets corroborates the unfavorable clinical impact of miR-181a overexpression on the treatment response and survival of serous ovarian patients. Finally, the evaluation of the additional impact of its overexpression on ameliorating the prognostic power of established clinical disease markers resulted in a superior positive prediction and an improved patients’ risk-stratification. Regarding the evaluation of tRNA-derived fragments (tRFs), the analysis of the TCGA-OV dataset, revealed the abundance of the i-tRFs and the high proportion of fragments derived from tRNAGlyGCC in ovarian tumors, while gene ontology analysis of i-tRF-GlyGCC predicted targets resulted in enriched key signaling pathways in ovarian cancer onset and progression. Strikingly, i-tRF-GlyGCC emerged as an independent and powerful prognostic indicator in epithelial ovarian cancer since its overexpression could accurately predict unfavorable overall survival and early progression. Moreover, multivariate prognosis models highlighted that i-tRF-GlyGCC evaluation ameliorates the prognostic power of widely-used clinical variables and offers superior risk-stratification of the patients. Finally, decision curve analysis (DCA) elucidated the significantly enhanced clinical net benefit of the multivariate models combining i-tRF-GlyGCC levels along with disease established markers in epithelial ovarian cancer prognostication. Ultimately, tRFs derived from pre-tRNAs, namely 3'U-tRFs, have also been studied in the present PhD thesis. Herein, following a primary clinical evaluation, target prediction and gene ontology analysis of 3’U-tRFs candidates, 3'U-tRF derived from pre-tRNAValCAC (3'U-tRFValCAC) was associated with adverse prognosis and linked to cell signaling, cell proliferation, and cell adhesion pathways, and, thus, was selected for further investigation. Strikingly, its ectopic expression in vitro significantly increased cell proliferation and migration of SK-OV-3 and OVCAR-3 tumor cells in a dose-dependent manner, verifying its active implication in key biological processes. By an in-depth clinical evaluation in the screening OVCAD and institutionally-independent TU Munich validation cohort, 3’U-tRFValCAC was unveiled as a powerful prognostic indicator in epithelial ovarian cancer since its elevated levels were statistically correlated with poor overall and progression-free survival. Moreover, multivariate analysis demonstrated that the inferior outcome of “3’U-tRFValCAC high” group is independent of the patients’ clinicopathological data and the established clinical markers. In this regard, 3’U-tRFValCAC-fitted multivariate models ameliorated the prognostic power of the clinically used markers and offered superior risk-stratification of the patients.

Ο καρκίνος των ωοθηκών (ovarian cancer, OC) είναι ο δεύτερος πιο συχνά διαγνωσμένος και ο πλέον θανατηφόρος γυναικολογικός καρκίνος στις ανεπτυγμένες χώρες, υπεύθυνος για ~5% των γυναικείων θανάτων από καρκίνο, παγκοσμίως. Παρόλο που η πρώιμη διάγνωση (FIGO I/II) οδηγεί σε 5ετή επιβίωση >90%, οι περισσότερες ασθενείς (~75%) διαγιγνώσκονται σε προχωρημένα στάδια της νόσου (FIGO III/IV) με αποτέλεσμα φτωχή ανταπόκριση στη χημειοθεραπεία, βραχυπρόθεσμη εξέλιξη της νόσου και 5ετή επιβίωση <25%, τη δυσμενέστερη μεταξύ όλων των γυναικολογικών κακοηθειών. Δυστυχώς, η έγκαιρη διάγνωση του καρκίνου των ωοθηκών αποδεικνύεται δύσκολη, ενώ η αξιοσημείωτη πρόοδος που έχει σημειωθεί στις χειρουργικές τεχνικές και τις στοχευμένες θεραπείες δεν έχει βελτιώσει σημαντικά το σχετικά υψηλό ποσοστό θανάτου των ασθενών με προχωρημένη νόσο. Επιπλέον, η υψηλή ετερογένεια του μοριακού υποβάθρου των όγκων και της ανταπόκρισης των ασθενών στη χημειοθεραπεία εμποδίζει την εξατομικευμένη πρόγνωση. Στο πλαίσιο αυτό, η αναγνώριση νέων μοριακών βιοδεικτών θα μπορούσε να αποτελέσει ένα πολύτιμο εργαλείο για την υποστήριξη ιατρικής ακριβείας και εξατομικευμένων αποφάσεων θεραπείας, και συνολικά τη βελτίωση της ποιότητας ζωής των ασθενών. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, αναγνωρίζοντας την κλινική ανάγκη εύρεσης νέων μοριακών βιοδεικτών στον καρκίνο των ωοθηκών, μελετήθηκε η ρύθμιση της έκφρασης και αξιολογήθηκε η κλινική σημασία μικρών μη-κωδικών μορίων RNA (non-coding RNAs, ncRNAs) στην πρόγνωση, την ανταπόκριση στην θεραπεία και την ανάλυση επιβίωσης των ασθενών με επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών. Σύμφωνα με το πρόγραμμα ENCODE, >75% του γονιδιώματος μεταγράφεται σε μη-κωδικά μόρια RNA. Μεταξύ αυτών, τα microRNAs (miRNAs) έχουν αναδειχθεί ως ισχυροί μετα-μεταγραφικοί ρυθμιστές της γονιδιακής έκφρασης. Επιπλέον, έχει διαπιστωθεί ότι πολλά miRNAs κατέχουν ογκογόνο ή ογκοκατασταλτικό ρόλο στον καρκίνο των ωοθηκών, αντιπροσωπεύοντας υποσχόμενους μοριακούς βιοδείκτες για την υποστήριξη της ιατρικής ακριβείας. Επιπρόσθετα, τα θραύσματα που προέρχονται από tRNA (tRNA-derived fragments, tRFs), τα οποία αρχικά θεωρήθηκαν ότι αποτελούν τυχαία παραπροϊόντα του μεταβολισμού των tRNAs, αποτελούν μια άφθονη και εξελικτικά διατηρημένη κατηγορία μικρών μη-κωδίκων RNAs με καθορισμένη αλληλουχία και βιολογικούς ρόλους. Στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής, η αξιολόγηση της κλινικής σημασίας του miR-203 στις δύο ανεξάρτητες ομάδες ασθενών (TU Munich και OVCAD) αποκάλυψε την ανεξάρτητη και δυσμενή προγνωστική αξία των αυξημένων επιπέδων του miR-203 για τους ασθενείς με επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών. Πιο συγκεκριμένα, αυξημένα επίπεδα του miR-203 συσχετίστηκαν με σημαντικά δυσμενέστερη επιβίωση των ασθενών έπειτα από κυτταρομειωτική χειρουργική επέμβαση και χημειοθεραπεία πρώτης γραμμής με πλατίνα, σε σύγκριση με ασθενείς με μειωμένη έκφραση του miR-203, ανεξάρτητα από το στάδιο FIGO, τον βαθμό κακοήθειας του όγκου, τον υπολειπόμενο όγκο, την απόκριση στη χημειοθεραπεία και την ηλικία. Επιπλέον, πολυπαραμετρικά μοντέλα που ενσωματώνουν την έκφραση του miR-203 με τους ευρέως χρησιμοποιούμενους κλινικούς δείκτες πρόγνωσης της νόσου προσέθεσαν κλινικό όφελος στη πρόβλεψη του θεραπευτικού αποτελέσματος και πέτυχαν σημαντικά καλύτερη διαστρωμάτωση κινδύνου των ασθενών. Η αξιολόγηση του miR-181a στις δυο εσωτερικές και σε τρεις εξωτερικές ομάδες ασθενών αποκάλυψε την συσχέτισή του με δυσμενή κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά των ασθενών και την ικανότητα υποστήριξης της εξατομικευμένης πρόγνωσης και πρόβλεψης ανταπόκρισης στην θεραπεία των ασθενών με ορώδη καρκίνο ωοθηκών. Πιο συγκεκριμένα, οι ασθενείς με υπερέκφραση του miR-181a συσχετίστηκαν σημαντικά με χειρότερη πρόγνωση μετά από κυτταρομειωτική χειρουργική επέμβαση και χημειοθεραπεία πρώτης γραμμής με πλατίνα, σε σύγκριση με τους ασθενείς με χαμηλότερα επίπεδα miR-181a. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει ότι το miR-181a διατήρησε την ανεξάρτητη προγνωστική του αξία σε πολυπαραμετρικά προγνωστικά μοντέλα, που συμπεριλάμβαναν το στάδιο FIGO, τον βαθμό κακοήθειας του όγκου, την υπολειπόμενη νόσο και την ανταπόκριση στη χημειοθεραπεία. Στην παρούσα μελέτη, η ανάλυση δύο ανεξάρτητων ομάδων ασθενών με διάμεσο χρόνο παρακολούθησης >5 ετών, και ταυτόχρονα τριών δημοσίως διαθέσιμων κλινικών μελετών ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών, επιβεβαίωσαν τη δυσμενή κλινική σημασία της υπερέκφρασης του miR-181a. Τέλος, η αξιολόγηση της αξίας του miR-181a στη βελτίωση της προγνωστικής ισχύος των καθιερωμένων δεικτών της νόσου παρείχε κλινικό όφελος και ανώτερη διαστρωμάτωση κινδύνου των ασθενών. Αναφορικά με την κλινική αξιολόγηση των θραυσμάτων που προέρχονται από tRNA (tRFs), η ανάλυση του συνόλου δεδομένων TCGA-OV (The Cancer Genome Atlas, TCGA) αποκάλυψε την αφθονία των i-tRFs και την υψηλή αναλογία θραυσμάτων που προέρχονται από το tRNAGlyGCC σε όγκους ωοθηκών, ενώ η ανάλυση γονιδιακής οντολογίας των προβλεπόμενων γονιδίων-στόχων του i-tRF-GlyGCC ανέδειξε βασικά μονοπάτια κυτταρικής σηματοδότησης που συμμετέχουν στην έναρξη και την εξέλιξη της νόσου. Επιπλέον, το i-tRF-GlyGCC αναδείχθηκε ως ένας ανεξάρτητος και ισχυρός προγνωστικός δείκτης στον επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών, με την υπερέκφρασή του να προβλέπει αποτελεσματικά τη δυσμενή ολική επιβίωση και τη βραχυπρόθεσμη εξέλιξη της νόσου. Επιπλέον, τα πολυπαραμετρικά μοντέλα πρόγνωσης επιβεβαίωσαν ότι η αξιολόγηση του i-tRF-GlyGCC βελτιώνει την προγνωστική δύναμη των κλινικά χρησιμοποιούμενων δεικτών, προσφέρωντας καλύτερη διαστρωμάτωση κινδύνου για τους ασθενείς και κλινικό όφελος στην διαχείριση του επιθηλιακού καρκίνου ωοθηκών. Τέλος, στην παρούσα διατριβή, μελετήθηκαν τα tRFs που προέρχονται από τα πρόδρομα tRNAs, τα 3'U-tRFs. Έπειτα από μια πρώτη κλινική αξιολόγηση, πρόβλεψη γονιδίων-στόχων και ανάλυση γονιδιακής οντολογίας των υποψηφίων 3'U-tRFs, το 3'U-tRF που προέρχεται από το pre-tRNAValCAC (3'U-tRFValCAC) συσχετίστηκε με δυσμενή πρόγνωση και αναδείχθηκε να συμμετέχει σε μονοπάτια κυτταρικής σηματοδότησης, κυτταρικού πολλαπλασιασμού και κυτταρικής προσκόλλησης, και επιλέχθηκε για περαιτέρω μελέτη. Αρχικά, η έκτοπη έκφραση του 3'U-tRFValCAC in vitro αύξησε σημαντικά το ρυθμό κυτταρικού πολλαπλασιασμού και τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων SK-OV-3 και OVCAR-3, με δοσοεξαρτώμενο τρόπο, επαληθεύοντας την ενεργό εμπλοκή του μορίου στις ανώτερες βιολογικές διαδικασίες. Η κλινική αξιολόγηση στην ομάδα ελέγχου OVCAD και στην ανεξάρτητη ομάδα επικύρωσης TU Munich, αποκάλυψε το 3'U-tRFValCAC ως έναν ισχυρό προγνωστικό δείκτη στον επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών, καθώς τα αυξημένα επίπεδά του συνδέθηκαν στατιστικώς σημαντικά με δυσμενή ολική επιβίωση και υψηλό κίνδυνο εξέλιξης των ασθενών με καρκίνο ωοθηκών σε συνέχεια της θεραπείας 1ης γραμμής. Επιπλέον, η πολυπαραμετρική ανάλυση έδειξε ότι η προγνωστική του αξία είναι ανεξάρτητη από τους καθιερωμένους κλινικούς δείκτες της νόσου, ενώ η ενσωμάτωση του βελτιώνει την προγνωστική ισχύ τους και τη διαστρωμάτωση κινδύνου των ασθενών.