Μοριακή δικτύωση γονιδίων και ενζύμων στην παραγωγή μεταβολιτών γνωστών για τις θεραπευτικές ιδιότητες στην ελιά

Abstract

The cultivated olive tree is a member of the Oleaceae family which is gifted with the capacity to biosynthesize an unusual group of secondary metabolites known as oleosides, which due to their uniqueness serve also as chemotaxonomic markers. Oleosides’s biosynthetic pathway has been a center of research interest in recent years, mainly for three reasons. These molecules, with oleuropein being the most abundant oleoside in olives, have an important defensive role for the plants of this family, have a beneficial and prominent bioactive action for humans and determine various quality and organoleptic characteristics of olive drupes and oil. In this study, three different enzymatic hubs are studied. Biotechnological procedures were developed in the attempt to characterize specific groups of enzymes and study their function in vivo. More specifically, the virus-induced gene silencing (VIGS) method was applied for the first time with success in olive plants. After the success of the method in olive plants, VIGS was applied to silence the β-glucosidase of the oleuropein, OeGLU, since OeGLU activity had been verified only by in vitro reactions. The silencing effect leads to unexpected results for olive secondary metabolism, indicating possible retrograde regulation of the pathway and highlighting the VIGS method as a very useful biotechnological approach. Additionally, biochemical and molecular properties of glycosyltransferase candidates were investigated. Glycosylation is an important enzymatic step of the secoiridoid pathway, and the first glycosylation has been proposed to take place in 7-deoxyloganetic acid synthesizing 7-deoxyloganic acid. Phylogenetic analysis with characterized plant glycosyltransferases, expression pattern among different organs, comparison with the profile of other known genes of the pathway, subcellular localization studies, and in silico analyses, were conducted. The experiments highlighted four sequences possibly engaged in this specific enzymatic step, while the VIGS method howed that two of them probably glycosylate 7-deoxyloganetic acid, as reduction of transcripts in olive plants resulted in a reduced concentration of oleuropein in olive’s leaves. Subcellular localization studies revealed that these four candidates are localized in both the nucleus and the cytoplasm further highlighting an active role of the nucleus in the compartmentalization of secondary metabolism enzymes. Lack of availability of the substrate hampered the in vitro validation of the ability to glycosylate 7-deoxyloganetic acid The final enzymatic step studied in this work is the methylesterase of elenolic acid (OeEAME2), an enzyme acting directly after the deglycosylation of oleuropein by OeGLU to generate oleacein. Expression analyses show that this enzyme probably acts during fruit ripening as high levels of expression were observed in this developmental stage. In addition, after heterologous expression in N. benthamiana, this enzyme was found to be located in the nucleus as well as in the cytoplasm. Fluorescence protein interaction experiments showed not only that two monomers are able to interact but also that it can interact with the C-terminus of OeGLU. In fact, this interaction takes place in the nucleus and cytoplasm showing that the presence of OeEAME2 can disrupt the compartmentalization between OeGLU and oleuropein. Finally, gel filtration chromatography showed that the quaternary structure of OeEMAE2 in planta is a dimer, while when OeGLU and OeEAME2 were co-expressed in tobacco leaves, the two enzymes interacted and were able to form a heteromultimeric supramolecular structure suggesting that this conformation may facilitate the synergistic enzymatic activity on oleuropein in order to produce oleacein.

Η οικογένεια των Oleaceae όπου ανήκει και η καλλιεργήσιμη ελιά είναι προικισμένη με την δυνατότητα βιοσύνθεσης μιας ομάδα δευτερογενών μεταβολιτών που είναι γνωστά ως ολεοσίδια, τα οποία λόγω μοναδικότητας έχουν χημειοταξινομικό χαρακτήρα για την οικογένεια. Το μονοπάτι της βιοσύνθεσης τους είναι κέντρο ερευνητικού ενδιαφέροντος τα τελευταία χρόνια, για τρεις βασικούς λόγους. Τα μόρια αυτά μαζί με την ολευρωπαΐνη, που είναι η πιο άφθονη μέσα στην ελιά, έχουν σημαντική αμυντική δράση για τα φυτά της οικογένειας, έχουν εξέχουσα βιοδραστική δράση για τον άνθρωπο και καθορίζουν διάφορα ποιοτικά και οργανοληπτικά χαρακτηριστικά των βρώσιμών καρπών και του λαδιού. Στην παρούσα εργασία μελετώνται τρεις διαφορετικοί ενζυματικοί κόμβοι. Στην προσπάθεια να χαρακτηριστούν συγκεκριμένες ομάδες ενζύμων αναπτύχθηκαν βιοτεχνολογικές προσεγγίσεις με στόχο να μελετηθεί in vivo η λειτουργία τους. Πιο συγκεκριμένα εφαρμόστηκε για πρώτη φορά η ιικοεπαγώμενη μέθοδος VIGS με επιτυχία σε φυτάρια ελιάς. Μετά την επιτυχία της μεθόδου στην ελιάς, η μέθοδος VIGS εφαρμόστηκε για να αποσιωπηθεί η β-γλυκοσιδάση της ολευρωπαΐνης OeGLU, ως συνέχεια των ερευνών του εργαστηρίου μας, αφού η δραστικότητας της είχε εξακριβωθεί σε in vitro αντιδράσεις. Το αποτέλεσμα της αποσιώπησης οδηγεί σε αναπάντεχα αποτελέσματα για τον δευτερογενή μεταβολισμό της ελιάς, υποδεικνύοντας πιθανή ανάδρομη ρύθμιση του μονοπατιού και αναδεικνύοντας τη μεθόδο VIGS σε πολύ χρήσιμη βιοτεχνολογική προσέγγιση. Στην συνέχεια, παρουσιάζεται η προσπάθεια χαρακτηρισμού της πρώτης γλυκοζυλίωσης που δέχεται το μονοπάτι πάνω στο άγλυκο μόριο του 7-δεοξυλογανικού οξέος (7-δεοξυλογανετικό οξύ) κατά την δημιουργία των σεκοϊριδοειδών. Στα πλαίσια της έρευνας πραγματοποιήθηκε φυλογενετική ανάλυση με χαρακτηρισμένες φυτικές γλυκοζυλοτρασφεράσες, ανάλυση του προτύπου έκφρασης σε διάφορα μέρη του φυτού, συγκρινόμενα με άλλα γνωστά γονίδια του μονοπατιού, πειράματα υποκυτταρικής τοποθέτησης, in silico αναλύσεις κ.α. Τα πειράματα καταδεικνύουν 4 αλληλουχίες πιθανές για το συγκεκριμένο ενζυμικό βήμα, ενώ η μέθοδος VIGS για τα τέσσερα αυτά ένζυμα δείχνει ότι πιθανώς δύο από αυτές να γλυκοζυλιώνουν το 7-δεοξυλογανετικό οξύ, καθώς αποσιώπηση των μεταγραφημάτων τους από τα φυτά ελιάς είχε σαν αποτέλεσμα μειωμένη συγκέντρωσης της ολευρωπαΐνης στα φύλλα της ελιάς. Η υποκυτταρική τοποθέτηση των ένζύμων σε πυρήνα και κυτταρόπλασμα αν και μένει να επιβεβαιωθεί και με άλλα πειράματα, αναδεικνύει όμως τον ιδιαίτερο ρόλο του πυρήνα στην διαμερισματοποίηση ενζύμων του δευτερογενή μεταβολισμού. Παρόλα αυτά εκκρεμεί η επιβεβαίωση της ενζυμικής δράσης, λόγω έλλειψης διαθεσιμότητας του υποστρώματος, που θα αποδείξει ποιο ή ποια από τα υπό μελέτη OeUGTs πραγματοποιούν την συγκεκριμένη αντίδραση. Το τελευταίο ενζυμικό βήμα που μελετήθηκε στην παρούσα εργασία είναι αυτό την δράσης μιας μεθυλεστεράσης (OeEAME2), που δρα μετά την απογλυκοζυλίωση της ολευρωπαΐνης από την OeGLU για να δημιουργηθεί η ολεασίνη. Οι αναλύσεις μεταγραφημάτων δείχνουν πως το ένζυμο αυτό πιθανώς να δρα κατά την ωρίμανση του καρπού καθώς εκεί παρατηρήθηκαν αυξημένα επίπεδα έκφρασης. Επιπλέον ύστερα από ετερόλογη έκφραση στο φυτό N. benthamiana βρέθηκε ότι τοποθετείται με στον πυρήνα των κυττάρων καθώς και στο κυτταρόπλασμα. Πειράματα αλληλεπίδρασης πρωτεϊνών μέσω φθορισμού έδειξαν όχι μόνο ότι το ένζυμο αλληλεπιδρά με τον εαυτό του αλλά και ότι μπορεί να αλληλεπιδράσει με το καρβόξυ- άκρο της OeGLU. Μάλιστα η αλληλεπίδραση αυτή εντοπίστηκε τόσο στον πυρήνα όσο και στο κυτταρόπλασμα δείχνοντας ότι η παρουσία της OeEAME2 μπορεί να διαταράξει την υποκυτταρική διαμερισματοποίηση ανάμεσα στην OeGLU και στην ολευρωπαΐνη. Τέλος η χρωματογραφία μοριακής διήθησης έδειξε ότι η OeEMAE2 φέρει τεταρτοταγή δομή και συγκεκριμένα ομοδιμερίζεται, ενώ πειράματα συνέκφρασης των OeGLU και OeEAME2 σε φύλλα καπνού, έδειξαν ότι τα δύο ένζυμα είναι δυνατόν να δημιουργούν μια ετεροπολυμερή μεγαλομοριακή δομή in planta η οποία πιθανώς να ευνοεί την συνεργιστική δράση των δυο ενζύμων προκειμένου να παραχθεί η ολεασίνη.