Αλληλεπίδραση αιμοπεταλίων με καρκινικά κύτταρα: ρόλος στις θρομβωτικές επιπλοκές του καρκίνου και την καρκινογένεση

Abstract

Introduction: Platelet-tumor cell interaction plays an important role in both carcinogenesis and thrombotic complications in cancer patients. The aim of this PhD thesis is to investigate the mechanisms of platelet-tumor cell interaction, to highlight those that play important roles in the interaction and activation of these cells, and finally to present new synthetic Nilotinib analogues that express strong antitumor activity. Methods: In this context, twelve new Nilotinib analogues, a BCR-ABL tyrosine kinase inhibitor used to treat chronic myelogenous leukemia, have been designed and synthesized by the Organic Chemistry laboratory, and their antiplatelet and antitumor properties were studied for the first time. Initially, Nilotinib and all the analogues were studied by light transmittance aggregometry to investigate their ability to inhibit platelet aggregation, in vitro, after activation with AA, ADP, TRAP-6 and U-46619. At the same time, we studied the interaction of these analogues with antiplatelet agents, such as Ticagrelor and Vorapaxar. Furthermore, the analogues were studied by impedance aggregometry in whole blood, in order to evaluate their antiplatelet activity, in more reassembling conditions of human blood, as the ones in in vivo experiments, as well as by flow cytometry, in order to investigate their activity on the membrane expression of P-selectin and PAC-1, after activation with AA. Finally, in order to delve more into their mechanism of action, we investigated by ELISA, their effect on the thromboxane synthesis pathway, after platelet activation with AA.We continued our study to evaluate their cytostatic and antimetastatic properties. First, we studied by flow cytometry, the effect of Nilotinib and its analogues on the cell cycle of HepG2 cells. The same study was performed after the incubation of HepG2 cells with lysine acetylsalicylate or platelets. Moreover, the analogues, as well as lysine acetylsalicylate, were examined for their apoptotic activity by flow cytometry. The apoptotic assay was also performed in healthy endothelial cells HUVECs, in order to evaluate their safety. Next, we investigated by Western Blot, the effect of Nilotinib and its analogues on the expression of two adhesion proteins, E-cadherin and N-cadherin. We continued by studying the effect of the analogues, as well as platelets, on the migration of HepG2 cells using the Boyden chamber assay. Finally, we investigated by ELISA, the effect of the analogues on the phosphorylation of Src kinase, in HepG2 cell lysates. Results: The analogues-1, -2, and -3 exhibited significantly stronger inhibitory effect against AA-induced platelet aggregation, compared to Nilotinib, while none of the analogues inhibited platelet aggregation when ADP, TRAP-6 or U-46619 were used as agonists. None of the analogues in combination with Ticagrelor demonstrated any interaction, whereas, all three analogues in combination with Vorapaxar revealed a synergistic effect, causing a significant increase in inhibition of platelet aggregation. In whole blood, only the analogue-3 was able to induce strong antiplatelet activity at a low concentration. Analogues-1, -2 and -3 strongly inhibited the membrane expression of P-selectin and PAC-1, even at low concentrations, while also exhibiting significant inhibition of TxB2 synthesis, compared to Nilotinib. Regarding HepG2 cells, Nilotinib caused a slight increase in the percentage of M1 phase cells, while conversely analogues-1, -2 and -3 caused a decrease in M1 phase cells and a significant increase in M3 phase cells. The analogues, lysine acetylsalicylate, as well as platelets, did not significantly change the distribution of cancer cells in the cell cycle. Nilotinib and analogues-1 and -3 demonstrated a significant decrease in viable cells, but only the analogue-3 exhibited strong apoptotic activity, while lysine acetylsalicylate did not affect the percentage of apoptotic cells at all. None of the analogues induced apoptosis in healthy endothelial cells HUVECs. Also, a large decrease in E-cadherin expression was observed by analogues-1 and -3, while analogues-2 and -3 caused a greater decrease in N-cadherin expression, compared to Nilotinib. All three analogues caused a significant reduction in metastatic HepG2 cells, whereas platelets failed to differentiate their migration rate. None of the three analogues affected the Src kinase, since they did not cause any significant effect in its phosphorylation. Conclusions: Analogues-1, -2 and -3, exhibited similar potent antiplatelet activity. Regarding their antitumor properties, analogue-1 and -3 appeared to have similar activity in most assays performed, with the analogue-3 revealing the strongest apoptotic activity in HepG2 cells. We therefore observed that the structural alterations made to the model compound of Nilotinib, enhanced both its antiplatelet and cytostatic properties. The results so far, indicate that there is a significant potential for the development of new synthetic TKIs, with potent antiplatelet activity and enhanced cytostatic properties, for the treatment of cancer and at the same time the effective prevention of CAT.

Εισαγωγή: Η αλληλεπίδραση αιμοπεταλίων-καρκινικών κυττάρων διαδραματίζει σημαντικό ρόλο τόσο στην καρκινογένεση όσο και στις θρομβωτικές επιπλοκές ασθενών με καρκίνο. Ο στόχος της της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι να εμβαθύνει περισσότερο στους μηχανισμούς αλληλεπίδρασης αιμοπεταλίων-καρκινικών κυττάρων, να αναδείξει αυτούς που διαδραματίζουν το σημαντικότερο ρόλο στην αλληλεπίδραση και ενεργοποίηση των κυττάρων αυτών και τέλος να αναδείξει νέα συνθετικά ανάλογα του Nilotinib που να εκφράζουν ισχυρή αντιαιμοπεταλιακή και αντικαρκινική δράση. Μέθοδοι: Στο πλαίσιο αυτό έχουν σχεδιαστεί και συντεθεί, από το εργαστήριο Οργανικής Χημείας, δώδεκα νέα ανάλογα του Nilotinib, ενός αναστολέα της BCR-ABL κινάσης, που χρησιμοποιείται στη θεραπεία της χρόνιας μυελογενούς λευχαιμίας και μελετήθηκαν για πρώτη φορά οι αντιαιμοπεταλιακές και αντικαρκινικές τους ιδιότητες. Αρχικά, μελετήθηκαν το Nilotinib και όλα τα ανάλογα, ως προς την ικανότητά τους να αναστείλουν τη συσσώρευση των αιμοπεταλίων, in vitro, μετά από ενεργοποίηση με ΑΑ, ADP, TRAP-6 και U-46619, με τη μέθοδο της συσσωρευομετρίας οπτικής διαπερατότητας. Παράλληλα, μελετήθηκε η αλληλεπίδραση των αναλόγων με αντιαιμοπεταλιακούς παράγοντες, όπως Ticagrelor και Vorapaxar. Στη συνέχεια, τα ανάλογα μελετήθηκαν με τη μέθοδο συσσωρευομετρίας εμπέδησης σε ολικό αίμα, ώστε να αξιολογηθεί η αντιαιμοπεταλιακή δραστικότητά τους σε συνθήκες όσο το δυνατόν πιο κοντινές στις in vivo συνθήκες που επικρατούν στο ανθρώπινο αίμα, καθώς και με κυτταρομετρία ροής, ώστε να διερευνηθεί η δράση τους ως προς τη μεμβρανική έκφραση της P-selectin και του PAC-1, μετά από ενεργοποίηση με ΑΑ. Τέλος, για να εμβαθύνουμε περισσότερο στο μηχανισμό δράσης των αναλόγων, διερευνήθηκε με τη μέθοδο της ELISA, η επίδρασή τους στο μονοπάτι σύνθεσης του θρομβοξανίου, μετά από ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων με ΑΑ. Συνεχίσαμε τη μελέτη μας για να αξιολογήσουμε τα ανάλογα ως προς τις κυτταροστατικές και αντιμεταστατικές τους ιδιότητες. Αρχικά, μελετήθηκε η επίδραση του Nilotinib και των δώδεκα αναλόγων στον κυτταρικό κύκλο των HepG2 κυττάρων, με τη μέθοδο της κυτταρομετρίας ροής. Παράλληλα, η ίδια μελέτη πραγματοποιήθηκε και μετά από επώαση των HepG2 κυττάρων με ακετυλοσαλικυλική λυσίνη ή αιμοπετάλια. Στη συνέχεια, εξετάστηκαν τα ανάλογα, αλλά και η ακετυλοσαλικυλική λυσίνη, ως προς την αποπτωτική τους δραστικότητα, με τη μέθοδο της κυτταρομετρίας ροής. Η μελέτη της αποπτωτικής δράσης των αναλόγων πραγματοποιήθηκε και σε υγιή ενδοθηλιακά κύτταρα HUVECs, ώστε να αξιολογηθεί η ασφάλεια χρήσης τους. Για να εμβαθύνουμε στη μελέτη των αναλόγων, διερευνήθηκε η επίδραση του Nilotinib και των αναλόγων στην έκφραση δύο πρωτεϊνών προσκόλλησης, της E-cadherin και της N-cadherin, με τη μέθοδο ανοσοαποτύπωσης Western Blot. Συνεχίσαμε μελετώντας την επίδραση των αναλόγων, αλλά και των αιμοπεταλίων, στη μετανάστευση των HepG2 κυττάρων με τη μέθοδο του θαλάμου Boyden. Τέλος, διερευνήθηκε η επίδραση των αναλόγων στη φωσφορυλίωση της Src κινάσης σε κυτταρολύματα HepG2 κυττάρων, με τη μέθοδο της ELISA. Αποτελέσματα: Τα ανάλογα-1, -2 και -3 εμφάνισαν σημαντικά ισχυρότερη ανασταλτική δράση έναντι της επαγόμενης από ΑΑ συσσώρευσης των αιμοπεταλίων, σε σύγκριση με το Nilotinib, ενώ κανένα από τα ανάλογα δεν ανέστειλε ικανοποιητικά τη συσσώρευση των αιμοπεταλίων, όταν χρησιμοποιήθηκαν ως αγωνιστές το ADP, το TRAP-6 ή το U-46619. Κανένα από τα ανάλογα σε συνδυασμό με Ticagrelor δεν εμφάνισε κάποια αλληλεπίδραση, ενώ αντίθετα, και τα τρία ανάλογα σε συνδυασμό με Vorapaxar εμφάνισαν συνεργατική δράση, προκαλώντας σημαντική αύξηση του ποσοστού αναστολής της συσσώρευσης των αιμοπεταλίων. Σε ολικό αίμα, μόνο το ανάλογο-3 μπόρεσε να προκαλέσει ισχυρή αντιαιμοπεταλιακή δράση σε χαμηλή συγκέντρωση. Τα ανάλογα-1, -2 και -3 ανέστειλαν ισχυρά τη μεμβρανική έκφραση της P-selectin και του PAC-1, ακόμα και σε χαμηλές συγκεντρώσεις και παράλληλα εμφάνισαν σημαντική αναστολή στη σύνθεση του TxB2, σε σύγκριση με το Nilotinib.Όσον αφορά στα HepG2 κύτταρα, το Nilotinib προκάλεσε μία μικρή αύξηση στο ποσοστό των κυττάρων της φάσης M1, ενώ αντίθετα τα ανάλογα-1, -2 και -3 προκάλεσαν μείωση των κυττάρων της φάσης M1 και σημαντική αύξηση των κυττάρων της φάσης M3. Τα υπόλοιπα ανάλογα, η ακετυλοσαλικυλική λυσίνη, καθώς και τα αιμοπετάλια, δεν επηρέασαν σημαντικά την κατανομή των καρκινικών κυττάρων στον κυτταρικό κύκλο. Το Nilotinib και τα ανάλογα-1 και -3 εμφάνισαν σημαντική μείωση των ζωντανών κυττάρων, αλλά μόνο το ανάλογο-3 εμφάνισε ισχυρή αποπτωτική δράση, ενώ η ακετυλοσαλικυλική λυσίνη δεν επηρέασε καθόλου το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων. Κανένα από τα ανάλογα δεν προκάλεσε απόπτωση σε υγιή ενδοθηλιακά κύτταρα HUVECs. Επίσης, παρατηρήθηκε μεγάλη μείωση της έκφρασης της E-cadherin, από τα ανάλογα-1 και -3, ενώ παράλληλα τα ανάλογα-2 και -3 προκάλεσαν μεγαλύτερη μείωση της έκφρασης της N-cadherin, σε σύγκριση με το Nilotinib. Και τα τρία ανάλογα προκάλεσαν σημαντική μείωση των μεταστατικών κυττάρων, ενώ τα αιμοπετάλια δεν κατάφεραν να διαφοροποιήσουν τη μετανάστευση των HepG2 κυττάρων. Κανένα από τα τρία ανάλογα δεν επηρέασε τη λειτουργία της Src κινάσης, αφού δεν προκάλεσαν κάποια σημαντική διαφορά στη φωσφορυλίωσή της. Συμπεράσματα: Τα ανάλογα-1, -2 και -3, παρουσίασαν παρόμοια ισχυρή αντιαιμοπεταλιακή δράση. Όσον αφορά στις αντικαρκινικές τους ιδιότητες, τα ανάλογα-1 και -3 φάνηκε να έχουν παρόμοια δραστικότητα στις περισσότερες μελέτες, με το ανάλογο-3 να εμφανίζει την ισχυρότερη αποπτωτική δράση στα HepG2 κύτταρα. Παρατηρήσαμε επομένως, ότι οι αλλαγές που πραγματοποιήθηκαν στην πρότυπη δομή του Nilotinib ενίσχυσαν και τις αντιαιμοπεταλιακές, αλλά και τις κυτταροστατικές ιδιότητές του. Τα μέχρι στιγμής αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι υπάρχει σημαντική δυνατότητα ανάπτυξης νέων συνθετικών TKIs, με ισχυρή αντιαιμοπεταλιακή δραστικότητα και ενισχυμένες κυτταροστατικές ιδιότητες, για τη θεραπεία του καρκίνου και παράλληλα την αποτελεσματική πρόληψη της CAT.