Μελέτη της σχέσης ιοειδών με παράγοντες των ξενιστών τους και ανάπτυξη μεθόδων για τη δημιουργία ανθεκτικών φυτών

Abstract

Viroids are tiny plant pathogens, which infect numerous angiosperm species and are capable to induce diseases of great economic importance. They are made of circular, single-stranded RNA and are divided into two families, according to their structural and functional characteristics. Viroids of the family Pospiviroidae reproduce inside the nucleus and form a rod-like secondary structure, while viroids of the family Avsunviroidae replicate in the chloroplasts and form a branched secondary structure, καθώς επίσης διαθέτουν ενεργότητα ριβοενζύμου. As viroids, unlike viruses, do not encode any proteins, they are entirely dependent on host factors for their entrance, transport and replication in plants. One of the most extensively studied viroids is Potato Spindle Tuber viroid (PSTVd), which is also the typical species of the family Pospiviroidae. In search of host factors that interact with viroids, a protein was identified in PSTVd-infected tomato (Solanum lycoperisicum), which strongly and specifically interacts with PSTVd in vivo and in vitro. This protein, which was named as VIROID-BINDING PROTEIN 1 (VIRP1), is localized in the nucleus and contains an atypical RNA-binding domain, where the PSTVd RNA is attached. A few years later, it was shown that VIRP1 is essential for PSTVd infectivity, as VIRP1-syppressed Nicotiana benthamiana plants (VIRP1i) were found resistant to PSTVd mechanical inoculation. Later studies suggested that VIRP1 facilitates PSTVd nuclear import, however the exact role of VIRP1 in PSTVd infectivity is still unclear. The simultaneous presence of a bromodomain and a Ν-extra-terminal (ΝΕΤ) domain classifies VIRP1 in the ΒΕΤ (bromodomain-andextra-terminal-domain) family, members of which are supposed to function as transcriptional activators. More specifically, the bromodomain is responsible for the recognitiom of acetylated lysine residues in histones, a signal that is translated into “open chromatin” and stimulates gene activation. The NET domain is responsible for the stratification of other protein factors, which συμμετέχουν in transcriptional activation. In this work, we aimed to study the endogenous role of VIRP1 in N. benthamiana, as well as to discover the effect of VIRP1 mutations in PSTVd infectivity. Furthermore, we utilized CRISPR/Cas9 technology to target genes encoding factors that are related to viroid infectivity, in order to create resistant plants. In these factors, we included VIRP1, as well as DICER-LIKE (DCL) proteins 2,3 and 4. To this end, we initially identified the total of BET proteins in tomato and N. benthamiana and created a combined phylogenetic tree to compare BET proteins in different plant species. Next, in order to explore the effect of VIRP1 in gene expression, we performed 3’ RNA sequencing in wild-type and και VIRP1i plants to identify differentially expressed genes. Our results showed that VIRP1 affects the expression of genes mainly related to photosynthesis, flowering and abiotic tress response through ABA. In line with the above results, VIRP1i plants show slightly delayed flowering, as well as reduced germination under ABA treatment. As for VIRP1 subnuclear localization, it was observed VIRP1 forms nuclear aggregates in healthy cells after fusion with YFP or GFP. This pattern is altered in PSTVd-infected cells, where the aggregates appear significantly larger in size. Furthermore, the formation of aggregates appears to be related to the NET domain, as its deletion leads to a localization throughout the nucleus. Also, attempts of immunodetection of VIRP1 show hat it is detected at low levels, and this also appears to be related to the NET domain. To target genes involved in viroid infectivity in the allotetraploid plant N. benthamiana, we used a CRISPR/Cas9 approach to mutate the genes of DCL2, DCL3, DCL4 and VIRP1. dcl mutants were evaluated based on their small RNA production, their phenotypic traits and/or PSTVd infectivity. virp1 mutants were evaluated based on the production of VIRP1 protein, as well as PSTVd infectivity. Furthermore, complementation test was achieved, based on a viral vector for VIRP1 overexpression. To further understand the role of VIRP1 in PSTVd infectivity, we focused on two hypotheses. The first one was to study the role of VIRP1 in PSTVd nuclear import. To test this hypothesis, we aimed to mutate specific aminoacids of VIRP1 in order to disrupt its nuclear import, and then overexpress these constructs in virp1 plants to estimate the effect on PSTVd infectivity. For this, we initially used prediction algorithms to identify putative nuclear localization signals. We found in total 5 putative nuclear localization signals and constructed the respective mutants, as well as several combinations, in fusion with YFP. However, we did not detect any cytoplasmic localization in any of the mutant constructs. Therefore, we assumed that VIRP1 nuclear localization is dictated by multiple signals, or by atypical sequences which are not recognized from prediction algorithms. The second hypothesis we wished to test is related to the subnuclear traffic of PSTVd. More specifically, viroids of the family Pospiviroidae replicate inside the nucleus via RNA polymerase ΙΙ. As the bromodomain of VIRP1 is predicted to recognize “open chromatin” and therefore sites of active transcription, it is possible to be located in nuclear sites proximal to RNA polymerase II. Thus, we aimed to test whether VIRP1 is involved in some pathway of viroid subnuclear transport. To this end, we initially studied the subnuclear localization of specific bromodomain mutants, in which conserved aminoacids are targeted. The results showed a significant difference of localization in mutants of residue N269, which exhibited aggregates larger in size and fewer in number. To test the effect of bromodomain mutations in PSTVd infectivity, the above mutants were overexpressed in virp1 plants using a viral vector. After PSTVd mechanical inoculation, we found that PSTVd infectivity was significantly reduced in plants overexpressing N269 mutants, a residue regarded as the most essential in bromodomain function. Based on the above results, it is suggested that the bromodomain of VIRP1 may be important in PSTVd infectivity.

Τα ιοειδή είναι μικροσκοπικά παθογόνα των φυτών, τα οποία προσβάλλουν ποικίλα είδη αγγειοσπέρμων και είναι ικανά να προκαλέσουν ασθένειες μεγάλης οικονομικής σημασίας. Αποτελούνται από κυκλικό, μονόκλωνο RNA και κατατάσσονται σε δύο οικογένειες, με βάση τα δομικά και λειτουργικά τους χαρακτηριστικά. Ιοειδή της οικογένειας Pospiviroidae αναπαράγονται εντός του πυρήνα και διαμορφώνουν μία ραβδοειδή δευτεροταγή δομή, ενώ ιοειδή της οικογένειας Avsunviroidae αναπαράγονται εντός των χλωροπλαστών και διαμορφώνουν διακλαδισμένη δευτεροταγή δομή, καθώς επίσης διαθέτουν ενεργότητα ριβοενζύμου. Καθώς τα ιοειδή, σε αντίθεση με τους ιούς, δεν κωδικοποιούν πρωτεΐνες, βασίζονται αποκλειστικά σε παράγοντες του ξενιστή για την είσοδο, τη μετακίνηση και την αναπαραγωγή τους. Ένα από τα καλύτερα μελετημένα ιοειδή είναι το ιοειδές των ατρακτοειδών κονδύλων της πατάτας (Potato Spindle Tuber viroid, PSTVd), το οποίο αποτελεί και το τυπικό είδος της οικογένειας Pospiviroidae. Προς αναζήτηση παραγόντων του ξενιστή που αλληλεπιδρούν με τα ιοειδή, εντοπίστηκε από το εργαστήριό μας μία πρωτεΐνη της ντομάτας (Solanum lycoperisicum), η οποία αλληλεπιδρά ειδικά και ισχυρά με το PSTVd in vivo και in vitro. Η πρωτεΐνη αυτή, η οποία ονομάστηκε VIROID-BINDING PROTEIN 1 (VIRP1), εντοπίζεται στον πυρήνα και περιέχει μία άτυπη επικράτεια πρόσδεσης RNA, όπου προσδένεται το PSTVd. Λίγο αργότερα δείχθηκε ότι η VIRP1 είναι απαραίτητη για τη μολυσματικότητα του PSTVd, καθώς φυτά Nicotiana benthamiana με καταστολή του μεταγράφου της VIRP1 (VIRP1i) βρέθηκαν ανθεκτικά σε μηχανικές μολύνσεις με PSTVd. Μετέπειτα μελέτες υποστήριξαν ότι η VIRP1 διευκολύνει την είσοδο του PSTVd στον πυρήνα, ωστόσο δεν είναι ακόμη σαφές κατά πόσον αυτή η υπόθεση ισχύει. Η ταυτόχρονη παρουσία μίας βρομοεπικράτειας (bromodomain) και μίας Ν-extra-τελικής επικράτειας (ΝΕΤ domain) στη VIRP1 την κατατάσσει στην οικογένεια των ΒΕΤ (bromodomain-and-extra-terminal-domain) πρωτεϊνών, τα μέλη της οποίας θεωρείται ότι λειτουργούν ως μεταγραφικοί ενεργοποιητές. Πιο συγκεκριμένα, η βρομοεπικράτεια είναι υπεύθυνη για την αναγνώριση ακετυλιωμένων καταλοίπων λυσίνης σε ιστόνες, ένα σήμα που μεταφράζεται σε «ανοιχτή χρωματίνη» και πυροδοτεί τη γονιδιακή ενεργοποίηση. Η ΝΕΤ επικράτεια είναι υπεύθυνη για την επιστράτευση άλλων πρωτεϊνικών παραγόντων που συμμετέχουν στην ενεργοποίηση της μεταγραφής. Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε ο ενδογενής ρόλος της VIRP1 στη N. benthamiana, καθώς και η επίδραση μεταλλαγών της VIRP1 στη μολυσματικότητα του PSTVd. Επιπλέον, εμαρμόστηκε η τεχνολογία CRISPR/Cas9 για τη στόχευση γονιδίων που κωδικοποιούν παράγοντες οι οποίοι σχετίζονται με τη μολυσματικότητα ιοειδών, με σκοπό τη δημιουργία ανθεκτικών φυτών N. benthamiana. Σε αυτά περιλαμβάνεται η VIRP1, καθώς και οι πρωτεΐνες DICER-LIKE (DCL) 2, 3 και 4. Αρχικά, εντοπίστηκαν όλες οι ΒΕΤ πρωτεΐνες στη ντομάτα και στη N. benthamiana και δημιουργήθηκε φυλογενετικό δέντρο για τη σύγκριση ΒΕΤ πρωτεϊνών σε διαφορετικά φυτικά είδη. Στη συνέχεια, προκειμένου να διερευνηθεί η επίδραση της VIRP1 στη γονιδιακή έκφραση, πραγματοποιήθηκε 3’ RNA αλληλούχηση σε φυτά αγρίου τύπου (WT) και VIRP1i για τον εντοπισμό διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η VIRP1 επηρεάζει την έκφραση γονιδίων που σχετίζονται κυρίως με τη φωτοσύνθεση, την άνθιση και την απόκριση στο αβιοτικό στρες μέσω του ΑΒΑ. Σε συμφωνία με τα παραπάνω αποτελέσματα, τα VIRP1i φυτά εμφανίζουν μία καθυστέρηση στην άνθιση, καθώς και μειωμένη ικανότητα βλάστησης παρουσία ΑΒΑ. Όσον αφορά στον υποπυρηνικό εντοπισμό της VIRP1, παρατηρήθηκε ότι η VIRP1 σχηματίζει συσσωματώματα εντός του πυρήνα υγιών κυττάρων μετά από σύντηξη με YFP ή GFP. Το πρότυπο αυτό φαίνεται να επηρεάζεται σε κύτταρα μολυσμένα με PSTVd, όπου τα συσσωματώματα εμφανίζονται σημαντικά μεγαλύτερα σε μέγεθος. Επιπλέον, ο σχηματισμός συσσωματωμάτων φαίνεται να σχετίζεται με τη ΝΕΤ επικράτεια, καθώς η διαγραφή της οδηγεί σε διάχυτο εντοπισμό της πρωτεΐνης εντός του πυρήνα. Ακόμη, προσπάθειες ανοσοεντοπισμού της VIRP1 δείχνουν ότι εντοπίζεται σε χαμηλά επίπεδα, κάτι που επίσης φαίνεται να σχετίζεται με τη ΝΕΤ επικράτεια. Για τη μεταλλαγή γονιδίων που σχετίζονται με τη μολυσματικότητα ιοειδών στο αλλοτετραπλοειδές φυτό N. benthamiana, αξιοποιήθηκε η τεχνολογία CRISPR/Cas9 και στοχεύτηκαν τα γονίδια των DCL2, DCL3, DCL4 και VIRP1. Τα dcl μεταλλάγματα αξιολογήθηκαν λειτουργικά βάσει του προτύπου παραγωγής μικρών RNAs, των φαινοτυπικών τους χαρακτηριστικών ή/και της μολυσματικότητας του ιοειδούς PSTVd. Τα virp1 μεταλλάγματα αξιολογήθηκαν βάσει της παραγωγής της πρωτεΐνης VIRP1, καθώς και ως προς τη μολυσματικότητα του PSTVd. Επιπλέον, επιτεύχθη έλεγχος συμπληρωματικότητας, μέσω χρήσης ενός ιικού φορέα για την υπερέκφραση της VIRP1 σε virp1 φυτά. Για την κατανόηση του ρόλου της VIRP1 στη μολυσματικότητα του PSTVd, θελήσαμε να ελέγξουμε δύο υποθέσεις. Η πρώτη αφορά στο ρόλο της VIRP1 στην είσοδο του PSTVd στον πυρήνα. Για να ελέγξουμε την υπόθεση αυτή, θελήσαμε να στοχεύσουμε συγκεκριμένα αμινοξέα της VIRP1 για την παρεμπόδιση της εισόδου στον πυρήνα και στη συνέχεια να υπερεκφράσουμε τις κατασκευές αυτές στα virp1 φυτά για την εκτίμηση της επίδρασης στη μολυσματικότητα του PSTVd. Για το σκοπό αυτό, αρχικά χρησιμοποιήσαμε αλγορίθμους πρόβλεψης για τον εντοπισμό των πιθανών σημάτων πυρηνικού εντοπισμού της VIRP1. Εντοπίστηκαν συνολικά 5 πιθανά σήματα πυρηνικού εντοπισμού και κατασκευάστηκαν τα αντίστοιχα μεταλλάγματα, καθώς και συνδυασμοί τους, σε σύντηξη με YFP. Ωστόσο, σε καμία περίπτωση δεν ανιχνεύθηκε κυτταροπλασματικός εντοπισμός της VIRP1. Επομένως, θεωρήθηκε ότι ο πυρηνικός εντοπισμός της VIRP1 καθορίζεται από πολλαπλά σήματα, ή από άτυπες αλληλουχίες που δεν αναγνωρίζονται από τους αλγορίθμους πρόβλεψης. Η δεύτερη υπόθεση που θελήσαμε να εξετάσουμε σχετίζεται με την υποπυρηνική μετακίνηση του PSTVd. Πιο συγκεκριμένα, τα ιοειδή της οικογένειας Pospiviroidae αναπαράγονται εντός του πυρήνα μέσω της RNA πολυμεράσης ΙΙ. Δεδομένου ότι η βρομοεπικράτεια της VIRP1 προβλέπεται να αναγνωρίζει «ανοιχτή χρωματίνη» και επομένως θέσεις ενεργού μεταγραφής, είναι πολύ πιθανό να εντοπίζεται σε σημεία του πυρήνα που βρίσκεται και η RNA πολυμεράση ΙΙ. Επομένως, θελήσαμε να ελέγξουμε κατά πόσον η VIRP1 εμπλέκεται σε κάποιο μονοπάτι υποπυρηνικής μετακίνησης του PSTVd. Έτσι, αρχικά μελετήθηκε ο υποπυρηνικός εντοπισμός συγκεκριμένων μεταλλαγμάτων της βρομοεπικράτειας, που αφορούν σε συντηρημένα αμινοξέα. Τα αποτελέσματα έδειξαν σημαντική διαφορά στον εντοπισμό σε μεταλλάγματα του αμινοξέος Ν269, τα οποία εμφάνισαν συσσωματώματα μεγαλύτερα σε μέγεθος και μικρότερα σε αριθμό. Για τη μελέτη της επίδρασης των μεταλλαγών της βρομοεπικράτειας στη μολυσματικότητα του PSTVd, τα παραπάνω μεταλλάγματα υπερεκφράστηκαν στα virp1 φυτά με τη χρήση ιικού φορέα. Μετά από μηχανικές μολύνσεις, τα επίπεδα του PSTVd βρέθηκαν σημαντικά μειωμένα στα φυτά με υπερέκφραση των μεταλλαγμάτων του αμινοξέος Ν269, το οποίο θεωρείται και ως το πιο σημαντικό για τη λειτουργία της βρομοεπικράτειας. Από τα παραπάνω αποτελέσματα, υποδεικνύεται ότι η βρομοεπικράτεια της VIRP1 ενδέχεται να παίζει σημαντικό ρόλο στη μολυσματικότητα του PSTVd.