Επιγενετικοί μηχανισμοί στην εκφυλιστική νόσο των αρθρώσεων

Abstract

Osteoarthritis (OA) is defined as a chronic, multifactorial, degenerative joint disease. Advanced age comprises the main risk factor in the development of OA, accompanied by modifications in all joint tissues that mainly involve cellular senescence and progressive degradation of the extracellular matrix, inflammation of the synovial fluid and dysregulation of the metabolic homeostasis of articular chondrocytes. In addition to aging, OA is a disease with a strong genetic component, as 50% of its incidence is attributed to heredity which, however, does not seem to adequately explain the aetiology of the disease. In an effort to clarify the underlying molecular mechanisms and gene regulation networks involved in the development of OA, currently the research has focused on epigenetics, that describes heritable phenotypic modifications that do not result from alterations in DNA sequence. A key molecule in the aetiology of OA is sirtuin 1 (SIRT1), which is a highly conserved NAD+ dependent histone and non-histonic protein deacetylase, as it regulates chondrocyte metabolic functions, inflammatory responses, mitochondrial biogenesis, senescence and apoptosis through deacetylation of its substrates, such as transcription factors and acetylated histones. It has been previously shown that in chronic inflammatory and age-related morbidities, including OA, where oxidative stress is increased, SIRT1 shows decreased expression levels, thus causing metabolic imbalance and increased inflammatory and catabolic activity in OA chondrocytes. The aim of the present PhD thesis was to investigate the epigenetic mechanisms involved in the regulation of SIRT1 expression and deacetylase activity in human OA chondrocytes. The experimental design of the thesis is composed of two parts. The first part investigated the role of DNA methylation in the regulation of SIRT1. The methylation pattern of SIRT1 promoter was analyzed in normal and OA chondrocytes using bisulfite DNA sequencing. Next, the binding affinity of the transcription factor C/EBPα to SIRT1 promoter was assessed by Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay. The interaction of C/EBPα and SIRT1 promoter, as well as SIRT1 expression levels were evaluated after treatment of OA chondrocytes with 5-Aza-2-Deoxycytidine (5-AzadC). The acetylation and nuclear levels of the p65 subunit of transcription factor Nuclear factor kappa-B (NF-κBp65), and the expression levels of the inflammatory mediators, interleukin 1β (IL-1β), IL-6 and TNFα, and catabolic genes (metalloproteinase- 1 (MMP-1) and MMP-9) and aggrecanase ADAMTS-5, were evaluated in OA chondrocytes treated with 5-AzadC, with or without subsequent transfection with siRNA against SIRT1. The second part investigated the role of a small non-coding RNA, miR-217-5p, in SIRT1 regulation in OA chondrocytes. MiR-217-5p gene-target prediction and enrichment analyses were performed using Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathways databases, while miR-217-5p expression levels were assessed in normal and OA chondrocytes. SIRT1 mRNA and protein expression levels, NF-κBp65 and p53 acetylation levels and the expression levels of inflammatory mediators [IL-1β, IL-6, TNFα], cartilage matrix regulating genes [MMP-1, MMP-9, MMP-13, COL2A1, ACAN] and pro-apoptotic markers [Bax, pro-caspase-3, cleaved caspase-3] associated with OA, were evaluated in OA chondrocytes treated with miR-217 mimic, as well as in miR-217 inhibitor-treated OA chondrocytes, with or without subsequent transfection with siRNA against SIRT1. The results of the first part of the research demonstrated hypermethylation of specific CpG dinucleotides on SIRT1 promoter, which was associated with decreased SIRT1 expression in OA chondrocytes. In addition, reduced binding ability of C/EBPα to the hypermethylated regions of SIRT1 promoter was observed. Treatment of OA chondrocytes with 5-AzadC restored C/EBPα transcriptional activity, inducing SIRT1 expression. Deacetylation of NF-κBp65 in OA chondrocytes treated with 5-AzadC was prevented by siSIRT1 transfection. Similarly, OA chondrocytes treated with 5-AzadC showed decreased expression of IL-1β, IL-6, MMP-1, and MMP-9 that was reversed after treating OA chondrocytes with 5-AzadC/siSIRT1. Concurrently, miR-217 target prediction and enrinchment analyses showed that SIRT1 is a miR-217 target-gene involved in OA pathology, while miR-217-5p directly targets SIRT1 mRNA with complete complimentarity. Mir-217-5p is overexpressed in OA chondrocytes, which partialty explains the observed downregulation of SIRT1 in OA chondrocytes. MiR-217 mimic transfection showed opposing results with miR-217 inhibitor treatment. Deacetylation of NF-κBp65 and p53 in OA chondrocytes treated with miR-217 inhibitor was reversed upon siSIRT1 tranfection, while OA chondrocytes treated with miR-217 inhibitor showed increased expression of COL2A1 and ACAN, and decreased expression of IL-1β, IL-6, TNFα, MMP-1, MMP-9, MMP-13, Bax, and cleaved caspase-3, which was reversed after miR-217 inhibitor/siSIRT1 treatment. In summary, the results of the present thesis highlight the effect of DNA methylation and miR-217-5p in suppressing SIRT1 deacetylase, which disrupts its protective anti-catabolic, anti-inflammatory and anti-apoptotic effects in OA chondrocytes, and further contributes to OA pathogenesis.

Η οστεοαρθρίτιδα (ΟΑ) ορίζεται ως μια χρόνια, πολυφαινοτυπική, εκφυλιστική ασθένεια των αρθρώσεων. Η προχωρημένη ηλικία αποτελεί τον κυριότερο παράγοντα κινδύνου στην εξέλιξη της ΟΑ, συνοδευόμενη από παθολογικές τροποποιήσεις σε όλους τους ιστούς των αρθρώσεων που αφορούν κυρίως τη γήρανση των κυττάρων, την προοδευτική αποικοδόμηση της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας, τη φλεγμονή του αρθρικού υγρού και την απορρύθμιση της μεταβολικής ομοιόστασης των αρθρικών χονδροκυττάρων. Πέραν του παράγοντα της γήρανσης, η ΟΑ αποτελεί ένα νόσημα με ισχυρή γενετική συνιστώσα, καθώς σε ποσοστό της τάξης του 50% αποδίδεται στην κληρονομικότητα, παράγοντας που, ωστόσο, δεν φαίνεται να εξηγεί επαρκώς την αιτιοαποθέγεια της νόσου. Στην προσπάθεια κατανόησης των υποκείμενων μοριακών μηχανισμών και της γονιδιακής ρύθμισης που λαμβάνει χώρα κατά την εξέλιξη της ΟΑ, τα τελευταία χρόνια το ερευνητικό ενδιαφέρον στρέφεται στην επιγενετική, η οποία περιγράφει κληρονομήσιμες φαινοτυπικές τροποποιήσεις που δεν προκύπτουν από αλλαγές στην αλληλουχία των βάσεων του DNA. Ένα μόριο-κλειδί στην αιτοπαθογένεια της ΟΑ αποτελεί η σιρτουίνη 1 (SIRT1), μια εξαιρετικά συντηρημένη NAD+ αποακετυλάση ιστονικών και μη πρωτεϊνών, η οποία ρυθμίζει τις μεταβολικές λειτουργίες των χονδροκυττάρων, τη φλεγμονώδη απόκριση, τη μιτοχονδριακή βιογένεση, τη γήρανση και την απόπτωση μέσω αποακετυλίωσης των υποστρωμάτων της, όπως μεταγραφικών παραγόντων και ακετυλιωμένων ιστονών. Έχει δειχθεί ότι σε χρόνιες φλεγμονώδεις και ηλικιοσχετιζόμενες νοσηρότητες, συμπεριλαμβανομένης της ΟΑ, όπου το οξειδωτικό στρες είναι αυξημένο, η SIRT1 εμφανίζει μειωμένη έκφραση, επιφέροντας διαταραχή της μεταβολικής ισορροπίας και αυξημένη φλεγμονώδη και καταβολική δραστηριότητα στα ΟΑ χονδροκύτταρα. Σκοπό της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτέλεσε η διερεύνηση των επιγενετικών μηχανισμών που συμμετέχουν στη ρύθμιση της έκφρασης και της δράσης της αποακετυλάσης SIRT1 σε ανθρώπινα ΟΑ χονδροκύτταρα. Το πειραματικό κομμάτι της διατριβής περιελάμβανε δύο σκέλη. Στο πρώτο σκέλος διερευνήθηκε ο ρόλος της μεθυλίωσης του DNA στη ρύθμιση της SIRT1. Το πρότυπο μεθυλίωσης του υποκινητή της SIRT1 αναλύθηκε σε φυσιολογικά και ΟΑ χονδροκύτταρα χρησιμοποιώντας ανάλυση αλληλούχισης κατόπιν κατεργασίας του DNA με διθειώδες άλας. Ακολούθως, η ικανότητα σύνδεσης του μεταγραφικού παράγοντα C/EBPα στον υποκινητή της SIRT1 αξιολογήθηκε με δοκιμασία ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης (Chromatin immunoprecipitation, ChIP). Στη συνέχεια, η αλληλεπίδραση του C/EBPα με τον υποκινητή της SIRT1 καθώς και τα επίπεδα έκφρασης της SIRT1 αξιολογήθηκαν μετά από χορήγηση του αναστολέα της μεθυλίωσης 5-Aza-2-Deoxycytidine (5-AzadC) στα ΟΑ χονδροκύτταρα. Τα επίπεδα ακετυλίωσης και πυρηνικού εντοπισμού της υπομονάδας p65 του μεταγραφικού παράγοντα Nuclear factor kappa-Β (NF-κΒp65), και τα επίπεδα έκφρασης των φλεγμονωδών μεσολαβητών ιντερλευκίνη 1β (IL-1β) και IL-6 και TNFa και των καταβολικών γονιδίων (μεταλλοπρωτεϊνάση-1 (MMP-1) και MMP-9) και αγγρεκανάση ADAMTS-5 που σχετίζονται με την ΟΑ, αξιολογήθηκαν σε ΟΑ χονδροκύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με 5-AzadC, με ή χωρίς μετέπειτα επίδραση με siRNA έναντι της SIRT1. Στο δεύτερο πειραματικό σκέλος της διατριβής διερευνήθηκε η συμμετοχή ενός μικρού μη-κωδικού RNA, του miR-217-5p, στη ρύθμιση της SIRT1 στα ΟΑ χονδροκύτταρα. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε βιοπληροφορική αναζήτηση και πρόβλεψη των γονιδίων-στόχων του miR-217-5p και ανάλυση της οντολογίας αυτών στις βάσεις δεδομένων Gene Ontology (GO) και Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathways, ενώ τα επίπεδα έκφρασης mir-217-5p αξιολογήθηκαν σε φυσιολογικά και ΟΑ χονδροκύτταρα. Τα επίπεδα έκφρασης mRNA και πρωτεΐνης της SIRT1, τα επίπεδα ακετυλίωσης των NF-κΒp65 και p53, και τα επίπεδα έκφρασης επιλεγμένων φλεγμονωδών μεσολαβητών [IL-1β, IL-6, TNFa], ρυθμιστικών γονιδίων του αρθρικού χόνδρου [MMP-1, MMP-9, MMP-13, COL2A1, ACAN] και προ-αποπτωτικών δεικτών [Bax, pro-caspase-3, cleaved caspase-3] που σχετίζονται με την ΟΑ, αξιολογήθηκαν σε ΟΑ χονδροκύτταρα που υποβλήθηκαν σε επίδραση με μιμητικό miR-217 (miR-217-mimic), καθώς και σε ΟΑ χονδροκύτταρα που υποβλήθηκαν σε επίδραση με αναστολέα του miR-217 (miR-217-inhibitor) με ή χωρίς επακόλουθη διαμόλυνση με siRNA έναντι της SIRT1. Τα αποτελέσματα του πρώτου ερευνητικού σκέλους έδειξαν υπερμεθυλίωση ειδικών δινουκλεοτιδίων CpG στον υποκινητή της SIRT1, που συσχετίστηκε με μείωση της έκφρασης της SIRT1 στα ΟΑ χονδροκύτταρα. Επιπλέον, παρατηρήθηκε μειωμένη ικανότητα δέσμευσης του C/EBPa στις υπερμεθυλιωμένες περιοχές του υποκινητή της SIRT1. Η χορήγηση 5-AzadC αποκατέστησε τη μεταγραφική δραστηριότητα του C/EBPα, επάγοντας την έκφραση της SIRT1 στα ΟΑ χονδροκύτταρα. Η αποακετυλίωση του NF-κΒp65 σε ΟΑ χονδροκύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με 5-AzadC αποτράπηκε με χορήγηση siSIRT1. Ομοίως, τα ΟΑ χονδροκύτταρα που έλαβαν 5-AzadC εμφάνισαν μειωμένη έκφραση των IL-1β, IL-6, MMP-1 και MMP-9 που αντιστράφηκε μετά από διπλή επίδραση με 5-AzadC/siSIRT1. Παράλληλα, από την εκτέλεση των βιοπληροφορικών αναλύσεων πρόβλεψης και οντολογίας των γονιδίων-στόχων του miR-217, φάνηκε ότι η SIRT1 αποτελεί ένα γονίδιο με εμπλοκή στην ΟΑ, που στοχεύεται άμεσα από το miR-217-5p, ενώ φάνηκε ότι το miR-217-5p υπερεκφράζεται στα ΟΑ χονδροκύτταρα, γεγονός που εξηγεί ως ένα βαθμό τα μειωμένα επίπεδα έκφρασης της SIRT1 στην ΟΑ. Τα αποτελέσματα της επίδρασης με miR-217-mimic ήταν αντίθετα των ευρημάτων από την επίδραση με miR-217 inhibitor. Η αποακετυλίωση των NF-κΒp65 και p53 σε ΟΑ χονδροκύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με miR-217 inhibitor αναστράφηκε κατόπιν επίδρασης με siSIRT1. Ομοίως, τα ΟΑ χονδροκύτταρα που έλαβαν αγωγή με miR-217 inhibitor εμφάνισαν αυξημένη έκφραση COL2A1, ACAN και μειωμένη έκφραση IL-1β, IL-6, TNFa, MMP-1, MMP-9, MMP-13, Bax και cleaved caspase-3, η οποία αντιστράφηκε μετά τη χορήγηση διπλής επίδρασης με miR-217 inhibitor/siSIRT1. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής αναδεικνύουν την επίδραση της μεθυλίωσης του DNA και του miR-217-5p στην καταστολή της αποακετυλάσης SIRT1, η οποία διαταράσσει την προστατευτική αντικαταβολική, αντιφλεγμονώδη και αντιαποπτωτική δράση της στα ΟΑ χονδροκύτταρα, και συμβάλλει περαιτέρω στη παθογένεση της ΟΑ.