Κλινική σημασία της έκφρασης των ενζύμων αποακετυλίωσης ιστονών σε νεοπλάσματα σιελογόνων αδένων

Abstract

Aim: Salivary gland tumors (SGTs) are of great clinical and research interest, due to their rarity, heterogeneity, potentially aggressive behavior, overlapping histopathological features and their complexed genetic and epigenetic profile. The aim of the study is a) to analyze for the first time and evaluate through immunohistochemistry (IHC) the expression of type-I and type-II histone deacetylating enzymes HDAC (-1, -2, -4, -6) in a significant representative sample of different subtypes of SGTs (benign and malignant), b) to conduct a comparative research between the induced and suppressed expression of HDACs in SGTs c) to statistically investigate significant correlations regarding HDACs expression and patient characteristics (age, sex), and d) to investigate the correlation between the differential expression of HDACs in malignant SGTs with clinicopathological features, and their utility as biomarkers, e) the possible correlations between HDAC overexpression and tumor differentiation characteristics. Also, by conducting a systematic analysis, the aim of this research is to investigate a) for the first time, through bioinformatics transcriptional data, the identification of important interacting and differentially expressed genes (DEGs) in adenoid cystic carcinoma (ACC), b) to validate the bioinformatics analysis results and further evaluate the protein expression levels of DEGs and histone repressive marks, c) review of the literature aiming tο locate related scientific findings regarding the differentially expressed enzymes that regulate histone modifications in SGTs. Methods: During the initial steps of the study, medical records, and archival histopathological material of a total of 58 SGT samples from an equal number of patients were utilized, including 36 cases of benign and 22 cases of malignant SGTs. This was followed by independent re-evaluation of representative sections of each case with hematoxylin-eosin staining by 2 different investigators to confirm the original histological diagnosis, according to the latest classification of head and neck tumors of the World Health Organization (2017). For HDAC-1 and HDAC-2 immunohistochemical staining, were used rabbit-derived polyclonal antibodies, and for HDAC-4 and HDAC-6, mice-derived monoclonal antibodies were used according to the manufacturer's instructions. Positive and negative controls were also performed. The staining was then evaluated, and the H-score was calculated for each case (H-score=score of staining extent + score of stain intensity), statistical analysis was performed (SPSS V25.0.0) and survival curves were constructed using the Kaplan-Meier method. The level of statistical significance for all statistical tests was set at p<0.05.In the second stage of the analysis, we extracted publicly available RNA-Seq data (Bioproject PRJNA287156) from 98 FFPE: 94 AKK and 4 normal salivary gland (SG) tissues. Sequencing of reads was performed on Ion Proton and Ion S5/XL sequencing systems (Thermo Fisher Scientific, USA). Read quality of raw single-end FASTQ files was assessed using FastQC (version 0.11.7). Fit trimming, quality and polyX was performed using fastp (version 0.20.0). Reads were mapped to a decoy-aware transcriptome (gencode41/GRh38) and gene expression quantification was performed using Salmon (version 1.1.0). Mapped reads <2 million were discarded from the sample. The detection of DEGs was performed with the DESeq2 algorithm, using the following statistical significance thresholds: a) False Discovery Rate (FDR)-adjusted p-value <0.05, b)|log2Fold-Change (FC)|>1or<-1 , c) mean value of DESeq2's normalized counts >2 million. 3rd generation enrichment analyses were applied to detect gene ontologies and KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) pathways that were overrepresented among induced and repressed genes using the of WebGestalt gene set analysis. The network analysis of DEGs was performed using Cytoscape (version 3.9.1) and the StringApp Plugin (version 2.0.1), a Cytoscape plugin that allows the import of STRING PPI networks. By querying: “histone modification” in stringApp, the network of interacting and associated histone modification DEGs was obtained. Then, a validation of the bioinformatic analysis was performed through IHC, using medical records and archival histopathological material (FFPE), from a total of 10 SGT patients: 2 benign (pleiomorphic adenomas, PA) and 8 malignant tumors (5 ACC, and 3 polymorphous adenocarcinomas, PAC). The IHC investigation was conducted utilizing the following proteins: Ki-67, p53, SUV39h1, Ezh2, HDAC8, H3K27me3 and H3K9me3. The results were evaluated by two independent researchers in terms of positivity, percentage, and intensity of staining, and finally the relevant literature was reviewed. Results: Induced expression of HDACs was detected in 25%-89% of HDAC positive SGTs. The protein expression of: a) HDAC-1 was expressed nuclearly in 31% of benign, and 14% of malignant OSA. b) HDAC-2 was detected (mainly nuclear) in 86% of benign and 82% of malignant cases. c) HDAC-4 was expressed in 44% of benign and 36% of malignant tumors, predominantly with a nuclear pattern. d) HDAC-6 was expressed in 11% of benign and 18% of malignant OSA, mainly cytoplasmically. In order to reduce sample heterogeneity, benign tumors were grouped with low-grade tumors and compared with high-grade tumors, and the comparison revealed statistically significant groups. HDAC-2 expression is a predictor of positive outcome and was associated with prolonged overall survival in malignant+high-grade SGTs. Overexpression of HDAC-6 was associated with a negative impact on overall survival in malignant+high-grade SGTs, whereas non-expression of HDAC-6 was associated with prolonged long survival. An HDAC-6 inhibitor is proposed as a candidate for improving patients’ survival. The expression of HDACs did not correlate with patients age and/or gender. A network of important protein-protein interaction (PPI) related to histone modifications was revealed for the first time through bioinformatic analysis in ACC. A significant upregulation of TP53 and the histone-modifying enzymes SUV39H1, EZH2, PRMT1, HDAC8, and KDM5B, along with the upregulation of DNA methyltransferase DNMT3A and ubiquitin ligase UHRF1 mRNA levels was detected in ACC tissues with downregulation of lysine acetyltransferase KAT2B levels. The analysis was further validated through protein expression of P53, SUV39H1, EZH2, HDAC8 along with the corresponding histone repressive marks: H3K9me3, H3K27me3. p53 expression was low in PA cases, while induced in PAK and AKK, confirming the relevant literature. EZH2 staining was weak in PA and PAK, and data we detected where in agreement with literature for induced EZH2 expression in AKK, while H3K27me3 expression was observed in all SGTs. The study is the first to detect induced mRNA levels as well as protein expression of SUV39H1 in ACC, compared to PA and PAC tissues. Whereas the induction of H3K9me3 in malignant PAC and ACC, compared to benign PA, indicates a possible functional role of SUV39H1, mediated by the induction of H3K9me3. Also, for the first time in the corresponding literature we detected a significantly induced expression (transcriptional and protein) of HDAC8 in malignant SGTs (ACC, PAC) compared to benign SGTs (PA), highlighting the scientific hypothesis for further researchers. Conclusions: Histone deacetylases and histone modifications play an important role in SGTs. Regarding histone deacetylases, in our study the expression of HDAC-2 emerges as an important positive prognostic factor for SGTs (good prognosis), while the expression of HDAC-6 as negative (poor prognosis). As overexpression of HDAC-6 was associated with poor prognosis, inhibition of HDAC-6 could contribute to improving the survival of these patients. Even though our study supports statistically significant results of clinical importance, the main criticism of such studies remains the small number of patients with rare neoplasms included in the study, and the heterogeneity of the histological groups within the studies. Further analysis, in larger cohorts on distinct histological subtypes of SGTs, is necessary for unraveling the prognostic role of HDACs in SGTs, and also to unlock their potential as therapeutic targets, using HDAC inhibitors for the management of SGTs patients. Overall, our study revealed a network of interacting histone modifying factors involved in SGT gene regulation, highlighting the critical role of epigenetic mechanisms in salivary gland tumorigenesis. Among the differentially expressed genes identified in ACCs, the key methyltransferases SUV39H1 and EZH2, as well as deacetylase HDAC8 were further detected overexpressed in tissue samples, confirming the DEG network as well as some previous studies. Moreover, the increased expression of histone repressive marks H3K9me3 and H3K27me3 in SGTs, suggests a possible functional role of SUV39H1 and EZH2, respectively, with a negative impact on gene regulation. Further studies are needed to confirm the possible physical interactions between the detected histone modifying factors as well as to elucidate the molecular mechanisms and functional role of the identified DEGs in SGTs.

Σκοπός: Οι ΟΣΑ εμφανίζουν μεγάλο κλινικό και ερευνητικό ενδιαφέρον, λόγω της σπανιότητας τους, της ετερογένειας, της εν δυνάμει επιθετικής συμπεριφοράς, των αλληλεπικαλυμμένων ιστοπαθολογικών τους χαρακτηριστικών αλλά και του πολύπλοκου γενετικού και επιγενετικού τους προφίλ. Σκοπός της μελέτης είναι α) η ανάλυση για πρώτη φορά και η αξιολόγηση της έκφρασης, των τάξεως-Ι και τάξεως-ΙΙ ενζύμων απακετυλίωσης ιστονών HDAC (-1, -2, -4, -6) σε ένα σημαντικό αντιπροσωπευτικό δείγμα διαφορετικών υποτύπων ΟΣΑ (καλοηθών και κακοήθων), β) η συγκριτική διερεύνηση μεταξύ της επαγόμενης έκφρασης και της κατεσταλμένης έκφρασης των HDAC στους ΟΣΑ γ) να διερευνηθούν οι στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις αναφορικά με την έκφραση των HDAC και τα χαρακτηριστικά των ασθενών (ηλικία, φύλο), δ) η διερεύνηση συσχέτισης της διαφοροποιημένης έκφρασης των HDAC σε κακοήθη ΟΣΑ με κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά, και η χρησιμότητα τους ως πιθανούς βιοδείκτες, ε) οι πιθανές συσχετίσεις μεταξύ υπερέκφασμένων HDAC και τα χαρακτηριστικά διαφοροποίησης του όγκου. Επίσης, μέσω συστηματικής ανάλυσης στόχος είναι α) να διερευνηθούν για πρώτη φορά μέσω βιοπληροφορικής ανάλυσης μεταγραφικά δεδομένα ώστε να εντοπίσουμε σημαντικά αλληλοεπιδρώντα ΔΕΓ στο ΑΚΚ, β) να γίνει έλεγχος επιβεβαίωσης των αποτελεσμάτων της βιοπληροφορικής ανάλυσης μέσω πρωτεϊνικής έκφρασης των ΔΕΓ και κατασταλτικών τροποποιήσεων ιστονών σε ΟΣΑ και γ) να πραγματοποιηθεί βιβλιογραφική ανασκόπηση με στόχο την εύρεση σχετικών επιστημονικών ευρημάτων αναφορικά με το δίκτυο των ΔΕΓ που ανιχνεύθηκε από την βιοπληροφορική ανάλυση. Μέθοδοι: Στο πρώτο στάδιο της μελέτης χρησιμοποιήθηκαν ιατρικά αρχεία και αρχειακό ιστοπαθολογικό υλικό συνολικά 58 δειγμάτων ΟΣΑ από ισάριθμους ασθενείς, αντιστοιχώντας σε 36 περιπτώσεις καλοηθών νεοπλασμάτων σιαλογόνων αδένων και 22 περιπτώσεις κακοήθων νεοπλασμάτων σιαλογόνων αδένων. Ακολούθησε ανεξάρτητη, εκ νέου αξιολόγηση αντιπροσωπευτικών τομών κάθε περίπτωσης, με χρώση αιματοξυλίνης-εωσίνης από 2 διαφορετικούς ερευνητές προς επιβεβαίωση της αρχικής ιστολογικής διάγνωσης σύμφωνα με την νεότερη ταξινόμηση των όγκων κεφαλής και τραχήλου του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας (2017). Για την ανοσοϊστοχημική χρώση των HDAC-1 και HDAC-2 έγινε χρήση πολυκλωνικών αντισωμάτων με προέλευση από λαγό, ενώ για τις χρώσεις των HDAC-4 και HDAC-6 έγινε χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων με προέλευση από μύες, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Επίσης, χρησιμοποιήθηκαν θετικοί και αρνητικοί μάρτυρες. Στη συνέχεια έγινε αξιολόγηση της χρώσης και υπολογίσθηκε το H-score κάθε περίπτωσης (H-score=score έκτασης χρώσης + score έντασης χρώσης), πραγματοποιήθηκε στατιστική ανάλυση (SPSS V25.0.0) και κατασκευάσθηκαν καμπύλες επιβίωσης με τη μέθοδο Kaplan-Meier. Το επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας για όλες τις στατιστικές δοκιμασίες ορίσθηκε το p<0.05. Στο δεύτερο στάδιο της ανάλυσης αντλήσαμε δημοσίως διαθέσιμα δεδομένα RNA-Seq (Bioproject PRJNA287156) συνολικά από 98 δείγματα FFPE, 94 ΑΚΚ και 4 φυσιολογικούς ιστούς ΣΑ. Η αλληλούχιση των αναγνώσεων πραγματοποιήθηκε σε συστήματα αλληλούχισης Ion Proton και Ion S5/XL (Thermo Fisher Scientific, ΗΠΑ). Η ποιότητα ανάγνωσης των ακατέργαστων αρχείων FASTQ «ενός άκρου» (single-end FASTQ) αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το FastQC (έκδοση 0.11.7). Η περικοπή προσαρμογής, η ποιότητα και το polyX πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας fastp (έκδοση 0.20.0). Οι αναγνώσεις χαρτογραφήθηκαν σε decoy-aware transcriptome (gencode41/GRh38) και η μέτρηση γονιδιακής έκφρασης εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το Salmon (έκδοση 1.1.0). Οι χαρτογραφημένες αναγνώσεις <2 εκατομμυρίων απορριφθήκαν από το δείγμα. Η ανίχνευση των ΔΕΓ πραγματοποιήθηκε με τον αλγόριθμο DESeq2, χρησιμοποιώντας τα εξής όρια στατιστικής σημαντικότητας: α) False Discovery Rate (FDR)-adjusted p-value <0,05, β)|log2Fold-Change (FC)|>1ή<-1, γ) μέση τιμή των DESeq2’s normalized counts>2 εκ. Εφαρμόστηκαν 3ης γενιάς αναλύσεις εμπλουτισμού προκειμένου να γίνει ανίχνευση των γονιδιακών οντολογιών και των μονοπατιών KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) τα οποία ήταν υπερεκπροσωπημένα μεταξύ των επαγόμενων και κατεσταλμένων γονιδίων χρησιμοποιώντας το εργαλείο ανάλυσης συνόλου γονιδίων WebGestalt. Η ανάλυση του δικτύου των ΔΕΓ πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το Cytoscape (έκδοση 3.9.1) και το StringApp Plugin (έκδοση 2.0.1), μια προσθήκη Cytoscape που επιτρέπει την εισαγωγή δικτύων STRING PPI. Μέσω ερωτήματος: «τροποποίηση ιστονών» στο stringApp, προέκυψε το δίκτυο των αλληλοεπιδρώντων και σχετικών με τροποποιήσεις ιστόνης ΔΕΓ. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε επικύρωση της βιοπληροφορικής ανάλυσης για την οποία χρησιμοποιήθηκαν ιατρικά αρχεία και αρχειακό ιστοπαθολογικό υλικό (FFPE) συνολικά από 10 ασθενείς με ΟΣΑ: 2 καλοήθεις (ΠΑ) και 8 κακοήθεις όγκους (5 AKK, και 3 ΠΑΚ) και προχωρήσαμε σε ανοσοϊστοχημική διερεύνηση των εξής πρωτεϊνών: Ki-67, p53, SUV39h1, EΖΗ2, HDAC8, H3K27me3 και H3K9me3. Τα αποτελέσματα αξιολογήθηκαν από δυο ανεξάρτητους ερευνητές ως προς τη θετικότητα, το ποσοστό, και την ένταση της χρώσης, και τέλος έγινε ανασκόπηση της σχετικής βιβλιογραφίας. Αποτελέσματα: Επαγόμενη έκφραση των HDAC ανιχνεύθηκε στο 25%-89% των θετικών σε έκφραση HDAC ΟΣΑ. Η πρωτεϊνική έκφραση έχει ως εξής: α) η HDAC-1 εκφράστηκε πυρηνικά στο 31% των καλοηθών, και 14% των κακοήθων ΟΣΑ, β) η HDAC-2 ανιχνεύθηκε (κυρίως πυρηνικά) στο 86% των καλοηθών και 82% των κακοήθων περιπτώσεων, γ) η HDAC-4 εκφράστηκε στο 44% των καλοήθων και 36% των κακοήθων όγκων, κυρίως με πυρηνικό μοτίβο, δ) Η HDAC-6 εκφράστηκε στο 11% των καλοηθών και στο 18% κακοήθων ΟΣΑ, κυρίως κυτταροπλασματικά. Προς μείωση της ετερογένειας του δείγματος, τα καλοήθη νεοπλάσματα ομαδοποιήθηκαν με τα χαμηλού βαθμού κακοήθειας νεοπλάσματα και συγκρίθηκαν με τα υψηλού βαθμού κακοήθειας νεοπλάσματα. Η σύγκριση ανέδειξε στατιστικά σημαντικές ομάδες. Συγκεκριμένα, η έκφραση της HDAC-2 αποτελεί προγνωστικό παράγοντα θετικής έκβασης, και σχετίστηκε με παρατεταμένη συνολική επιβίωση σε κακοήθειες ΚΑΙ υψηλού βαθμού ΟΣΑ. Η υπερέκφραση της HDAC-6 συνδέθηκε με αρνητικό αντίκτυπο στην συνολική επιβίωση των κακοήθων και υψηλού βαθμού ΟΣΑ, καθώς η μη έκφραση της HDAC-6 συσχετίστηκε με παρατεταμένη συνολική επιβίωση. Συνεπώς, η αναστολή του HDAC-6 προτάθηκε για τη βελτίωση της επιβίωσης αυτών των ασθενών. Η έκφραση των επιμέρους HDAC δεν συσχετίστηκε με την ηλικία και το φύλο των ασθενών. Αναδείχθηκε για πρώτη φορά μέσω βιοπληροφορικής ανάλυσης στο ΑΚΚ ένα δίκτυο σημαντικών αλληλοεπιδρώντων πρωτεϊνών, σχετικών με τις τροποποιήσεις των ιστονών. Το δίκτυο των ΔΕΓ ανέδειξε σημαντικά επαγόμενη έκφραση α) στο ογκοκατασταλτικό γονίδιο TP53, β) τις μεθυλτρανσφεράσες: SUV39H1, EZH2 και PRMT1, γ) την αποακετυλάση ιστόνης HDAC8, δ) τα ένζυμα μεθυλίωσης του DNA: DNMT3A, UHRF1 και KDM5B. Σημαντικά κατεσταλμένη έκφραση ανιχνεύθηκε στην ακετυλοτρανσφεράση λυσίνης KAT2B/PCAF. Η ανάλυση επικυρώθηκε περαιτέρω μέσω πρωτεϊνικής έκφρασης των P53, SUV39H1, EZH2, HDAC8 και των κατασταλτικών τροποποιήσεων ιστόνης: H3K9me3, H3K27me3. Η έκφραση της p53 ήταν χαμηλή στις περιπτώσεις των ΠΑ, και επαγόμενη σε ΠΑΚ και ΑΚΚ, επιβεβαιώνοντας τη σχετική βιβλιογραφία. Η χρώση της EΖΗ2 ήταν ασθενής σε περιπτώσεις ιστών ΠΑ και ΠΑΚ, ενώ σε συμφωνία με βιβλιογραφικά δεδομένα ανιχνεύσαμε επαγόμενη έκφραση στα ΑΚΚ, ενώ η έκφραση της H3K27me3 παρατηρήθηκε σε όλους τους ΟΣΑ. Η μελέτη είναι η πρώτη που ανιχνεύει επαγόμενα επίπεδα mRNA αλλά και πρωτεϊνικής έκφρασης της SUV39H1 σε ΑΚΚ, σε σύγκριση με ιστούς ΠΑ και ΠΑΚ. Ενώ, η επαγωγή της H3K9me3 στα κακοήθη ΠΑΚ και ΑΚΚ, σε σύγκριση με τα καλοήθη ΠΑ, υποδεικνύει ενδεχόμενο λειτουργικό ρόλο της SUV39H1, μεσολαβούμενο από την επαγωγή της H3K9me3, στους ΟΣΑ. Επίσης για πρώτη φορά ανιχνεύσαμε σημαντικά επαγόμενη έκφραση (μεταγραφικά και πρωτεϊνικά) της HDAC8 σε κακοήθη ΟΣΑ (ΑΚΚ,ΠΑΚ) συγκριτικά με καλοήθη (ΠΑ), τονίζοντας την επιστημονική υπόθεση για περαιτέρω ερευνά. Συμπεράσματα: Οι αποακετυλάσες ιστόνης και οι τροποιήσεις ιστόνης διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στους ΟΣΑ. Αναφορικά με τις αποακετυλάσες ιστόνης, στη μελέτη μας η έκφραση της HDAC-2 αναδεικνύεται ως σημαντικός θετικός προγνωστικός παράγοντας για τους ΟΣΑ (καλή πρόγνωση), ενώ η έκφραση της HDAC-6 ως αρνητική (κακή πρόγνωση). Καθώς η υπερέκφραση της HDAC-6 συσχετίστηκε με κακή πρόγνωση, η αναστολή της HDAC-6 θα μπορούσε να συμβάλλει στη βελτίωση της επιβίωσης αυτών των ασθενών. Παρά το γεγονός πως η μελέτη μας υποστηρίζει στατιστικά σημαντικά αποτελέσματα κλινικής σημασίας, η κύρια μομφή τέτοιων μελετών παραμένει ο μικρός αριθμός ασθενών με σπάνια νεοπλάσματα που ενσωματώνονται στη μελέτη, και η ετερογένεια των ιστολογικών ομάδων εντός των μελετών. Περαιτέρω ανάλυση, σε μεγαλύτερες εργασίες επί συγκεκριμένων ιστολογικών υποτύπων ΟΣΑ, κρίνεται απαραίτητη τόσο για την επαλήθευση του ουσιαστικού προγνωστικού ρόλου των HDAC στους ΟΣΑ αλλά και να αναδειχθούν οι δυνατότητές τους ως θεραπευτικοί στόχοι, μέσω των αναστολέων HDAC, στους ασθενείς με ΟΣΑ. Επιπλέον, η μελέτη μας ανέδειξε ένα δίκτυο αλληλoεπιδρώντων παραγόντων τροποποίησης ιστονών που εμπλέκονται στη γονιδιακή ρύθμιση των ΟΣΑ, υπογραμμίζοντας τον κρίσιμο ρόλο των επιγενετικών μηχανισμών στην ογκογένεση των νεοπλασμάτων των σιελογόνων αδένων. Μεταξύ των διαφορικώς εκφρασμένων γονιδίων που εντοπίστηκαν στα ΑΚΚ, οι κρίσιμες μεθυλοτρανσφεράσες SUV39H1 και EZH2, καθώς και η αποακετυλάση ιστόνης HDAC8 ανιχνεύθηκαν περαιτέρω υπερεκφρασμένες σε δείγματα ιστών, επιβεβαιώνοντας το δίκτυο ΔΕΓ καθώς και ορισμένες προηγούμενες μελέτες [244, 245]. Επιπλέον, η αυξημένη έκφραση των τροποποιήσεων καταστολής ιστονών H3K9me3 και H3K27me3 στους ΟΣΑ, υποδηλώνει έναν πιθανό λειτουργικό ρόλο των SUV39H1 και EZH2, αντίστοιχα, με αρνητικό αντίκτυπο στη γονιδιακή ρύθμιση. Τέλος, απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να επιβεβαιωθούν οι πιθανές φυσικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των ανιχνευόμενων παραγόντων τροποποίησης των ιστονών καθώς και να αναδειχθούν οι μοριακοί μηχανισμοί και ο λειτουργικός ρόλος των παραπάνω ΔΕΓ σε όγκους σιελογόνων αδένων.