Διερεύνηση των πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων που εξαρτώνται από τη φωσφορυλίωση του επαγόμενου από την υποξία παράγοντα HIF-1α και του ρόλου τους στην προσαρμογή των καρκινικών κυττάρων στην υποξία

Abstract

Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) is the key transcriptional regulator of the cellular response to hypoxia. Apart from oxygen, the regulation of HIF-1α subunit is also mediated by numerous post-translational modifications, such as phosphorylation. It is noteworthy that two HIF-1α modifications, previously identified in our laboratory, have an opposite effect on its action. Phosphorylation of HIF-1α by the protein kinase CK1δ reduces HIF-1 activity. Conversely, phosphorylation by ERK1/2 allows HIF-1α to accumulate in the nucleus and enhance HIF-1 activity. Our work was focused on the following questions: 1) Does phosphorylation by ERK1/2 regulate HIF-1α interaction with other proteins and protein expression under hypoxic conditions? 2) How do these two competing phosphorylations (by ERK1/2 and CK1δ) regulate HIF-1α function? To answer these questions, HIF1A-/- cell lines that do not express endogenous HIF-1α were generated, which by stable transfection express different forms of HIF-1α that carry mutations in the phosphorylation sites by ERK1/2. Using these cells, it was shown that HIF-1α expression and its phosphorylation by ERK1/2 are critical for cell survival in hypoxia, as the latter affects HIF-1α protein interactions in chromatin. Regarding the second question, the expression of combinatorial mutants of HIF-1α at the sites of phosphorylation by the two kinases indicated that in fact, at any given time in the cell, there are distinct fractions of HIF-1α that are phosphorylated by each kinase and serve different functions of HIF-1α. Further examining HIF-1α mutants localized outside the nucleus, it was shown that mimicking HIF-1α phosphorylation by CK1δ resulted in the translocation of the non-nuclear form of HIF-1α from mitochondria to microtubules. At the same time, it was shown that the endogenous protein is localized in the microtubules of the mitotic spindle interacting with tubulin, only when CK1δ is active. This interaction results in the symmetrical distribution of HIF-1α in the two new daughter cell nuclei, constituting a novel mechanism of HIF-1α regulation by phosphorylation.

Ο επαγόμενος από την υποξία παράγοντας-1 (HIF-1) είναι ο βασικός μεταγραφικός μεσολαβητής της κυτταρικής απόκρισης στην υποξία. Η ρύθμιση της HIF-1α υπομονάδας του εκτός από το οξυγόνο ρυθμίζεται και από ένα μεγάλο αριθμό μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων, όπως η φωσφορυλίωση. Είναι αξιοσημείωτο ότι δύο τροποποιήσεις που είχαν ταυτοποιηθεί στο εργαστήριο μας έχουν αντίθετο αποτέλεσμα στη δράση του HIF-1. Η φωσφορυλίωση του HIF-1α από την κινάση πρωτεϊνών CK1δ μειώνει την ενεργότητα του HIF-1. Αντίθετα, η φωσφορυλίωση από τις ERK1/2 επιτρέπει τη συσσώρευση του HIF-1α στον πυρήνα και την ενίσχυση της δραστικότητας του HIF-1. Η παρούσα εργασία εστιάστηκε στα ακόλουθα ερωτήματα: 1) Ρυθμίζει η φωσφορυλίωση από τις ERK1/2 την αλληλεπίδραση του HIF-1α με άλλες πρωτεΐνες και την έκφραση πρωτεϊνών σε συνθήκες υποξίας; 2) Πώς δύο ανταγωνιστικές τροποποιήσεις (από τις ERK1/2 και τη CK1δ) ρυθμίζουν ταυτόχρονα τη λειτουργία του HIF-1α; Για να απαντηθούν τα ερωτήματα, δημιουργήθηκαν HIF1A-/- σειρές που δεν εκφράζουν τον ενδογενή HIF-1α, οι οποίες με σταθερή διαμόλυνση εκφράζουν τις μορφές του HIF-1α που φέρουν μεταλλάξεις στις θέσεις φωσφορυλίωσης από τις ERK1/2. Χρησιμοποιώντας τα κύτταρα αυτά, δείχθηκε ότι η έκφραση του HIF-1α και ειδικότερα η φωσφορυλίωση του από τις ERK1/2 είναι κρίσιμα γεγονότα για την επιβίωση των κυττάρων στην υποξία, καθώς η τροποποίηση αυτή επηρεάζει τις πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις του HIF-1α στη χρωματίνη. Όσον αφορά το δεύτερο ερώτημα, η έκφραση συνδυαστικών μεταλλαγμάτων του HIF-1α στις θέσεις φωσφορυλίωσης από τις δύο κινάσες υπέδειξε ότι στην πραγματικότητα, κάθε στιγμή στο κύτταρο, υπάρχουν διακριτά κλάσματα του HIF-1α που είναι φωσφορυλιωμένα από την κάθε κινάση και εξυπηρετούν τις διαφορετικές λειτουργίες του HIF-1α. Εξετάζοντας περαιτέρω τις μεταλλαγμένες HIF-1α μορφές που εντοπίζονται εκτός πυρήνα, δείχθηκε ότι η μίμηση της φωσφορυλίωσης του HIF-1α από την CK1δ οδήγησε στη μετακίνηση της μη πυρηνικής μορφής του HIF-1α από τα μιτοχόνδρια προς τους μικροσωληνίσκους. Παράλληλα, δείχθηκε ότι, η ενδογενής πρωτεΐνη εντοπίζεται στους μικροσωληνίσκους της μιτωτικής ατράκτου αλληλεπιδρώντας με την τουμπουλίνη, μόνο όταν η CK1δ είναι ενεργή. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα τη συμμετρική κατανομή του HIF-1α στους δύο νέους πυρήνες των θυγατρικών κυττάρων, αποτελώντας ένα νέο μηχανισμό ρύθμισης του HIF-1α από τη φωσφορυλίωση.