Η εκτίμηση της έκφρασης της μεθυλίωσης του DNA στα γονίδια του αναστολέα της μεταλλοπρωτεϊνάσης 3 του υποστρώματος (TIMP-3) και της κινάσης της πρωτεΐνης της σχετιζόμενης με τον θάνατο (DAPK) σε ασθενείς με προκαρκινικές και καρκινικές αλλοιώσεις ενδοστοματικά, ως μέσο πρώιμης διάγνωσης και πρόβλεψης της εξέλιξης των αλλοιώσεων

Abstract

Introduction: Potentially malignant disorders such as Oral Lichen Planus(OLP) or Leukoplakia(L) of several degrees of dysplasia manifest a significant potential of malignant transformation being a precursor to the development of oral squamous cell carcinoma (OSCC). The latter, in turn, composes a critical cause of death being responsible for 325.000 deaths every year. Thus, it gets understood that the early detection of the malignant transformation of potentially malignant lesions, as well as the prediction of the evolution of OSCC, may prevent the evolution of a potentially malignant to a malignancy, as well as the local outspread of the latter through infiltration, its metastasis and finally its remission improving this way the life expectancy of the patients. In light of this need, the discovery of several markers that are able to fulfill them is extremely important. In particular the study of such markers through detection of their epigenetic profile and especially that of methylation proves to be remarkably interesting. In addition the process of verification of the previously described methylation profile by the investigation of the protein expression of the genes that code for these markers in the categories of the lesions mentioned above takes out a great deal of interest as well. Taking into consideration all previous information, the aim of the present study is to investigate the expression of the methylated –inactive form of DAPK or alternatively named DAPK-1(9q21.33) and TIMP-3 (22q12.1–q13.2) genes by the use of ms-PCR(methylation specific Polymerase Chain Reaction) as well as to detect the expression of the genes’ protein products in samples of OLP, L of no dysplasia and of several degrees of dysplasia and in OSCC OF all stages of differentiation ,that were previously embedded in paraffin, by the use of immunohistochemistry. Materials and Methods: The study focuses on the evaluation of hypermethylation of DAPK-1(VWR - Providing Life Science Products and Service Solutions, Radnor, USA) and TIMP-3( VWR - Providing Life Science Products and Service Solutions, Radnor, USA) through methylation specific Polymerase Chain Reaction (ms-PCR) in tissue samples of 21 cases of OLP, 11 of those being of reticular and 10 out of 21 of erosive type, 62 cases of leukoplakia subdivided into 21 with no dysplasia, 22 with mild dysplasia and 19 with moderate/severe dysplasia and 39 cases of OSCC. 12 tissue sections of fibromas excised adjacent to normal mucosa were included to the control group. The evaluation of the hypermethylation of the promoter regions of the two studied genes followed the isolation and quantification of the genetic material obtained from paraffin-embedded tissue sections ,a processed fulfilled by the use of the Maxwell 16 FFPE Tissue LEV DNA Purification kit by PROMEGA,USA and by the adjustment of the Nanodrop ND-1000, Qubit HS protocol respectively. Then the disulfide treatment was completed by the use of a special kit(EZ DNA Methylation Gold kit. ZymoResearch, USA). Finally methylation was estimated by ms-PCR (methylation specific PCR). Statistical analysis was performed using SPSS version 29.0 (IBM Corporation, Armonk, NY, USA). The frequencies of DCC and DAPK Hypermethylation in OLs, OSCCs and normal tissues were compared by Pearson chi-square Test and Fisher’s exact Test. A two-sided p-value < 0.05 was considered statistically significant. Furthermore, throughout the second part of the study , the immunohistochemcal expression pattern of DAPK-1( NBP2-38468Novus Biologicals a biotechne brand,Centennial, Colorado, USA) biomarker was investigated using the Dako Envision System Flex + (Dako Denmark A/S). The tissue samples were obtained from 6 cases of OLP( 3 of reticular and 3 of erosive form), 30 cases of leukoplakia(10 with no dysplasia, 10 with mild dysplasia and 10 with moderate/severe dysplasia) as well as 22 cases of OSCC(5 being well differentiated, 16 being moderately differentiated and 1 of poor differentiation). The staining was evaluated exclusively in a quantitative manner, since no variation in the intensity of the staining among the different samples was observed, by calculating the percentage of positive cells throughout the whole thickness of the epithelium, into a 0-III scale classified as: 0 when less than 5% of cells were stained, I when 6-25% of cells were stained, II when 26-50% of cells were stained, III when more than 50% of cells were stained. Statistical analysis was performed using SPSS version 29.0 (IBM Corporation, Armonk, NY, USA). . The degree of IHC staining in OL,s OSCCs, and normal tissues were compared using non non-parametric Mann-Whitney U Test. A two-sided p-value < 0.05 was considered statistically significant. The tissue samples were retrieved from the archives of the Department of Oral Medicine/Pathology, School of Dentistry, Aristotle University of Thessaloniki, as well as from St Lukas Hospital of Thessaloniki, Greece during the period 2004-2019. Τhe relevant experiments were carried out and completed in the Department of Oral Medicine/ Pathology School of Dentistry and the Laboratory of Molecular Biology of Bioiatriki S.A. Results: A universal absence of TIMP-3 methylation was found out in all lesions of all categories of lesions with the exception of 2 cases of leukoplakia with mild dysplasia and 1 case of OSCC. DAPK-1 methylation levels were found significantly increased in OLP of erosive type than in the reticular one (p=0,007 Fisher’s exact Test).In the whole sum of OLP cases methylation levels were significantly lower than in the OSCC cases(p<0,001 chi- square Test). DAPK-1 methylation in leukoplakia lesions with mild dysplasia was significantly increased compared to leukoplakias with moderate/severe dysplasia(p<0,001 chi- square Test) and decreased compared to OSCCs(p<0,001 chi- square Test). The distribution of DAPK-1 methylation was greater in OSCCs compared to that in normal tissues (p<0,001 Fisher’s exact Test). Ιn addition higher levels of methylation were revealed in OSCC lesions compared to both methylation levels in leukoplakias without dysplasia (p<0.001 Fisher's exact Test) as well as compared to leukoplakias of any degree of dysplasia (p<0.001 Fisher's exact Test). Regarding the immunohistochemical analysis of DAPK-1 expression in OLP, leukoplakias and OSCC (which was mainly cytoplasmic, sometimes membranous and rarely nuclear) it was found that DAPK-1 was expressed significantly less (quantitatively) in leukoplakias with moderate/severe dysplasia compared to normal tissues(p=0,013 Mann-Whitney U Test), to OLP (p=0,002 Mann-Whitney U Test), to leukoplakias without dysplasia ( p=0.019 Mann-Whitney U Test) and to leukoplakias with mild dysplasia ( p=0.019 Mann-Whitney U Test). Furthermore, as expected DAPK-1 expressed significantly less in OSCCs than in normal tissues (p=0.003 Mann-Whitney U Test). Its staining was more intense in OLP than n OSCCs (p<0,001 Mann-Whitney U Test) and more intense in leukoplakias with no dysplasia ( p=0.003 Mann-Whitney U Test) as well as in leukoplakias with mild dysplasia ( p=0.003 Mann-Whitney U Test) than in OSCCs. Discussion: The evaluation of the methylation profile of DAPK-1 in OLP as well as in malignant lesions confirms its utility as a potential predicting biomarker of malignant transformation in OLP lesions and especially in lesions of erosive form. Furthermore the study of DAPK-1 methylation reveals a diagnostic and prognostic value of the marker mainly at the point of the transition between the leukoplakia with mild dysplasia to leukoplakia with moderate and severe dysplasia and secondarily at the point of transition between the latter and OSCC. Of course, the application of DAPK-1 as a diagnostic and prognostic marker in daily clinical practice presupposes, a prior to it, extensive study in an adequately large sample of lesions and the correlation of both DAPK-1 gene promoter methylation and DAPK-1 kinase protein expression with parameters such as smoking, alcohol consumption or certain medicine.

Εισαγωγή: Οι δυνητικά κακοήθεις βλάβες στην στοματική κοιλότητα όπως ο ομαλός λειχήνας (ΟΛ) ή η λευκοπλακία(Λ) διαφόρων βαθμών δυσπλασίας εμφανίζουν σημαντικό δυναμικό κακοήθους εξαλλαγής με αποτέλεσμα πολλές φορές να αποτελούν προπομπό της ανάπτυξης καρκινώματος του πλακώδους επιθηλίου (ΚΠΕ) στη στοματική κοιλότητα. Το τελευταίο με τη σειρά του αποτελεί σημαντική αιτία θανάτου προκαλώντας περίπου 325 .000 θανάτους ετησίως. Έτσι γίνεται κατανοητό ότι η πρώιμη ανίχνευση της πιθανότητας κακοήθους εξαλλαγής των δυνητικά κακοήθων βλαβών αλλά και η εκτίμηση της πρόγνωση της εξέλιξης του ΚΠΕ πιθανώς να είναι ικανή να αποτρέψει την εξέλιξη μιας βλάβης σε κακοήθεια όπως και την επέκταση της κακοήθειας μέσω διήθησης, την μετάσταση και τέλος την υποτροπή της με αποτέλεσμα την βελτίωση του προσδόκιμου ζωής των ασθενών. Υπό το πρίσμα αυτών των αναγκών η εύρεση δεικτών που θα μπορούν να τις εξυπηρετήσουν είναι εξαιρετικά σημαντική. Ειδικότερα η μελέτη τους, μέσω της σκιαγράφησης του προφίλ των επιγενετικών τους μεταβολών και ιδιαίτερα της μεθυλίωσης, αποδεικνύεται ιδιαίτερα ενδιαφέρουσα όπως και η διαδικασία επαλήθευσης αυτής της συμπεριφοράς μέσω της διερεύνησης της πρωτεϊνικής τους έκφρασης στις κατηγορίες βλαβών που περιγράφονται παραπάνω. Με βάση τα παραπάνω ως σκοπός της μελέτης μας ορίστηκε η διερεύνηση της έκφρασης αφενός της υπερμεθυλιωμένης –ανενεργής μορφής των γονιδίων DAPK-1 (9q21.33) και TIMP-3 (22q12.1–q13.2) με τη χρήση ms-PCR, αφετέρου της πρωτεϊνικής έκφραση τους σε δείγματα ΟΛ, Λ διαφόρων βαθμών δυσπλασίας και χωρίς δυσπλασία , αλλά και ΚΠΕ χαμηλής, μετρίας και καλής διαφοροποίησης, τα οποία προηγουμένως σκηνώθηκαν σε παραφίνη, με τη χρήση ανοσοιστοχημείας. Μέθοδοι κα Υλικά: Η μελέτη αναφέρεται στην αξιολόγηση της υπερμεθυλίωσης των γονιδίων DAPK ή όπως αλλίως ονομάζεται DAPK-1( VWR - Providing Life Science Products and Service Solutions, Radnor,USA) και TIMP-3( VWR - Providing Life Science Products and Service Solutions, Radnor,USA) μέσω της μεθόδου της ειδικής της μεθυλίωσης αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (ms-PCR/ Methylation Specific Polymerase Chain Reaction) σε ιστοτεμάχια από 21 περιστατικά ΟΛ , 11 δικτυωτής και 10 διαβρωτικής μορφής, 62 περιστατικά λευκοπλακίας , 21 χωρίς δυσπλασία,22 με ήπια δυσπλασία , 19 με μέτρια/σοβαρή δυσπλασία όπως και από 39 περιστατικά ΚΠΕ της στοματικής κοιλότητας. Ως ομάδα ελέγχου χρησιμοποιήθηκαν 12 ιστοτεμάχια από φυσιολογικό επιθήλιο το οποίο ήταν παρακείμενο σε εξαιρεθέντα ινώματα εξ ‘ ερεθισμού. Η αξιολόγηση της υπερμεθυλίωσης των υποκινητών των γονιδίων πραγματοποιήθηκε αφού προηγήθηκε αρχικά η απομόνωση και ποσοτικοποίηση του γενετικού υλικού από τους παραφινοποιημένους ιστούς με τη χρήση των Maxwell 16 FFPE Tissue LEV DNA Purification kit του οίκου PROMEGA Αμερικής και προτοκόλλου Nanodrop ND-1000, Qubit HS αντίστοιχα. Στη συνέχεια έλαβε χώρα η προσθήκη δισουλφιδικών με την χρήση ειδικού κιτ (EZ DNA Methylation Gold kit. ZymoResearch,USA ) και τέλος η μεθυλίωση με τη μέθοδο ms –PCR(methylation specific PCR). H στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με το λογισμικό SPSS 29.0 και την εφαρμογή των Pearson chi-square test και Fisher’s exact test ενώ το επίπεδο σημαντικότητας ορίστηκε στο p<0.05. Στο δεύτερο μέρος της μελέτης διερευνήθηκε η ανοσοιστοχημική έκφραση του βιοδείκτη DAPK-1( NBP2-38468Novus Biologicals a biotechne brand,Centennial, Colorado, USA) του οποίου η χρώση ολοκληρώθηκε με τη βοήθεια του συστήματος Dako Envision System Flex + (Dako Denmark A/S). Τα ιστοτεμάχια προήλθαν από 6 περιστατικά ΟΛ , 3 δικτυωτής και 3 διαβρωτικής μορφής, 30 περιστατικά λευκοπλακίας , 10 χωρίς δυσπλασία , 10 με ήπια δυσπλασία και 10 με μέτρια και σοβαρή δυσπλασία, όπως και 22 περιστατικά ΚΠΕ(5 καλής διαφοροποίησης, 16 μέτριας διαφοροποίησης και 1 χαμηλής διαφοροποίησης. Η χρώση αξιολογήθηκε ποσοτικά ,μιας και δεν παρατηρήθηκε διακύμανση στην ένταση της στα διάφορα δείγματα , μέσω μίας κλίμακας από το 0 έως το ΙΙΙ η οποία αντιστοιχεί στα κάτωθι : 0: <5% των κυττάρων σε όλο το πάχος του επιθηλίου χρωματίστηκαν, Ι: 6-25% των κυττάρων σε όλο το πάχος του επιθηλίου χρωματίστηκαν, ΙΙ: 26-50% των κυττάρων σε όλο το πάχος του επιθηλίου χρωματίστηκαν, ΙΙΙ: >50% των κυττάρων σε όλο το πάχος του επιθηλίου χρωματίστηκαν. ). H στατιστκή ανάλυση πραγματοποιήθηκε με το λογισμικό SPSS 29.0 και την εφαρμογή του Mann-Whitney U test ενώ το επίπεδο σημαντικότητας ορίστηκε στο p<0.05. Τα ιστοτεμάχια προέρχονται από το τα αρχεία του Εργαστηρίου Στοματολογίας της Οδοντιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, της Κλινικής της και του Τμήματος της Γναθοπροσωπικής Χειρουργικής της Κλινικής του Αγίου Λουκά κατά την χρονική περίοδο 2014-2019. Η εργαστηριακή διαδικασία πραγματοποιήθηκε και ολοκληρώθηκε στους εργαστηριακούς χώρους του τμήματος Στοματολογίας του Οδοντιατρικού Τμήματος του ΑΠΘ και στους αντίστοιχους του τμήματος Μοριακής Βιολογίας της Βιοιατρικής Αθηνών( Bioiatriki S.A. Athens, Greece). Αποτελέσματα: Διαπιστώθηκε καθολική απουσία της μεθυλίωσης του TIMP-3 στο σύνολο των βλαβών όλων των κατηγοριών πλην 2 περιστατικών λευκοπλακίας με ήπια δυσπλασία και 1 περιστατικού ΚΠΕ. Αναφορικά με την μεθυλίωση του DAPK-1 , στις βλάβες ΟΛ διαβρωτικής μορφής εμφανίστηκε στατιστικά αυξημένη έναντι των αντίστοιχων του ΟΛ δικτυωτής μορφής(p=0,007 Fisher’s exact Test). Επίσης , στον ΟΛ συνολικά η μεθυλίωση ήταν μειωμένη συγκριτικά με την μεθυλίωση στα ΚΠΕ(p<0,001 chi- square Test). Η μεθυλίωσης του DAPK-1 στις βλάβες Λ με ήπια δυσπλασία ήταν μεγαλύτερη από αυτήν στις βλάβες Λ με μέτρια/σοβαρή δυσπλασία (p<0,001 chi- square Test) και μικρότερη έναντι της μεθυλίωσης στις βλάβες ΚΠΕ(p<0,001 chi- square Test). Επίσης η κατανομή της μεθυλίωσης ήταν μεγαλύτερη στα ΚΠΕ έναντι των φυσιολογικών ιστών(p<0,001 Fisher’s exact Test). Επιπλέον διαπιστώθηκε μεγαλύτερη παρουσία μεθυλίωσης στις βλάβες ΚΠΕ έναντι τόσο των βλαβών Λ χωρίς δυσπλασία (p<0,001 Fisher’s exact Test), όσο και έναντι των αντίστοιχων Λ οποιουδήποτε βαθμού δυσπλασίας (p<0,001 Fisher’s exact Test). Αναφορικά με την ανοσοιστοχημική έκφραση της DAPK-1 (η οποία ήταν κυρίως κυτταροπλασματική ,ενίοτε μεμβρανική και σπανιότερα πυρηνική) σε αντίστοιχες βλάβες ΟΛ, Λ και ΚΠΕ διαπιστώθηκαν ότι η έκφραση της DAPK-1 ήταν εντονότερη (ποσοτικά) στους φυσιολογικούς ιστούς (p=0,013 Mann-Whitney U Test) και στον ΟΛ (p=0,002 Mann-Whitney U Test) στην Λ χωρίς δυσπλασία ( p=0.019 Mann-Whitney U Test) και στην Λ με ήπια δυσπλασία( p=0.019 Mann-Whitney U Test) έναντι της Λ με μέτρια/σοβαρή δυσπλασία. Επιπλέον όπως αναμενόταν η χρώση της DAPK-1 ήταν ηπιότερη στα ΚΠΕ έναντι των φυσιολογικών ιστών(p=0,003 Mann-Whitney U Test), έναντι του ΟΛ (p<0,001 Mann-Whitney U Test), έναντι των Λ χωρίς δυσπλασία( p=0.003 Mann-Whitney U Test) και έναντι των Λ με ήπια δυσπλασία( p=0.003 Mann-Whitney U Test). Συζήτηση: Το προφίλ μεθυλίωσης του DAPK-1 στις βλάβες ΟΛ έναντι του αντίστοιχου των κακοήθων βλαβών επιβεβαιώνει την χρησιμότητα του στην πράξη ως πρώιμου δείκτη πρόβλεψης πιθανής κακοήθους εξαλλαγής ιδιαίτερα των βλαβών ΟΛ διαβρωτικής μορφής. Επίσης, η έκφραση της μεθυλίωσης του DAPK-1 παρουσιάζει διαγνωστική και προγνωστική αξία κυρίως στην μετάπτωση της λευκοπλακίας με ήπια δυσπλασία στην λευκοπλακία με μέτρια και σοβαρή δυσπλασία και δευτερευόντως στην μετάπτωση από την τελευταία στα ΚΠΕ. Επιπλέον, η έκφραση του πρωτεϊνικού προϊόντος του DAPK-1 εγείρει ενδείξεις ως προς την εκτίμηση της φλεγμονής ως δείκτη κακοήθους εξαλλαγής σε βλάβες ΟΛ. Βέβαια η χρήση της DAPK-1 ως δείκτη στην καθημερινή κλινική πράξη προϋποθέτει την ερευνητική μελέτη του σε ένα μεγάλο δείγμα βλαβών και τη συσχέτιση τόσο της μεθυλίωσης του υποκινητή του γονιδίου DAPK-1, όσο και της έκφρασης της πρωτεΐνης της κινάσης DAPK-1 με παραμέτρους όπως το κάπνισμα, η κατανάλωση αλκοόλ αλλά και η λήψη κάποιων φαρμάκων.