Δομικές και λειτουργικές μελέτες φωσφορυλασών των α-γλυκανών

Abstract

The α-glucan phosphorylases of the glycosyltransferase family are important enzymes of carbohydrate metabolism in prokaryotes and eukaryotes. Glycogen and starch serve as energy stores in animals and plants, respectively. The majority of glycogen is stored in the liver and skeletal muscle. A main function of glycogen is to maintain a physiological blood glucose concentration, but only liver glycogen directly contributes to release of glucose into the blood. Glycogen phosphorylase catalyzes the first step in the intracellular degradation of glycogen to yield glucose 1-phosphate (G1P). Apart from the enzyme active site several other peripheral binding sites have been reported for GP, the allosteric, new allosteric, inhibitor, quercetin, and glycogen storage site. These sites provide a range of options for the design of structurally diverse inhibitors with therapeutic potential as antihyperglycemics for Type 2 Diabetes patients. In this Thesis a series of compounds designed to bind to the peripheral GP binding sites were studied by kinetics and X-ray crystallography. The inhibitory potency of a collection of 75 polyphenol compounds (flavonoids and anthocyanidins) was studied. The most potent inhibitor was found to be baicalein (Ki = 5.3 μΜ) which binds at the inhibitor site. Pelargonidin (an anthocyanidin), was found bound at the quercetin binding site of GP displaying a Ki value of 31.1 μΜ for hlGPa. G02 was the most potent inhibitor among those that bind at the allosteric site of the enzyme (Ki = 5.8 µM). The inhibitory potency of another collection of 10 polyaromatic compounds was also evaluated against GP. The most potent inhibitor for hlGPa was PA7 (Ki = 7.87 μΜ) and it was found bound at the new allosteric site. Starch is an insoluble polymer of glucose residues produced by most higher plant species and is a major storage product of many of the seeds and storage organs produced agriculturally and used for human consumption. All higher plant starches are synthesized inside plastids. Their phosphorolytic degradation is catalyzed by starch phosphorylases (SP) and to date little is known about plastid starch phosphorylases (Pho1). We present here a biochemical analysis of stPho1 together with the crystal structure of stPho1ΔL78, a form of stPho1 which is composed by two segments generated by proteolytic degradation of an approximately 65 residue long peptide (L78) located in the middle of the stPho1 primary structure. stPho1ΔL78 is 1.5 times more active than the non-proteolyzed enzyme in solution and shows stronger specificity than stPho1 for glycogen, α-D-glucose, caffeine, and β-cyclodextrin. The crystal structure of stPho1ΔL78 has been resolved at 2.2 Å resolution and revealed similarities and differences to the mammalian enzymes. The structural fold is conserved as is the active site, and the indole binding site while others such as the inhibitor, the glycogen storage, the quercetin, and the allosteric are not. The binding of α-D-glucose, caffeine, and β-cyclodextrin to stPho1 has been studied by X-ray crystallography and revealed significant differences from the mammalian phosphorylases. As stPho1 is capable of catalyzing both starch synthesis and degradation our crystal structures suggested that the direction of stPho1 activity is regulated through proteolytic degradation of the L78 peptide. This is the first time that a plant phosphorylase has been biochemically and structurally characterized in detail and might be the starting point for further studies in plant phosphorylases.

Οι φωσφορυλάσες των α-γλυκανών είναι αποικοδομητικά ένζυμα των πολυγλυκανών και απαντώνται στο ζωικό και στο φυτικό βασίλειο. Οι πολυσακχαρίτες με τη μορφή αμύλου και γλυκογόνου αποτελούν κύριες αποθήκες ενέργειας πολλών οργανισμών. Το γλυκογόνο, μια άμεσα κινητοποιούμενη μορφή αποθήκευσης της γλυκόζης εντοπίζεται στο ήπαρ και στους σκελετικούς μύες. Ο ελεγχόμενος μεταβολισμός του στο ήπαρ και η απελευθέρωση γλυκόζης ρυθμίζουν τη διατήρηση των επιπέδων γλυκόζης στο αίμα. Η φωσφορυλάση του γλυκογόνου (GP) καταλύει το πρώτο στάδιο της ενδοκυτταρικής αποικοδόμησης του γλυκογόνου και βρίσκεται στο κέντρο του κατευθυνόμενου από τη δομή σχεδιασμού ενώσεων που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν στη φαρμακευτική αντιμετώπιση του ΣΔ2. Στο πλαίσιο της διατριβής μελετήθηκαν ενώσεις που στοχεύουν τα περιφερειακά κέντρα της GP. Με κινητικές μελέτες προσδιορίστηκε η βιοδραστικότητα και η σταθερά αναστολής τους (Ki), ενώ η δομική βάση της αναστολής τους αποκαλύφθηκε από την κρυσταλλογραφική μελέτη των ενζυμικών συμπλόκων των αναστολέων. Η πρώτη ομάδα αναστολέων που αξιολογήθηκε η ανασταλτική δράση τους στη GP ήταν μια συλλογή 75 πολυφαινολικών ενώσεων, που περιλάμβανε φλαβονοειδή και ανθοκυανίνες. Η βαικαλεΐνη βρέθηκε να είναι η πλέον βιοδραστική με τιμή Ki 5,3 μΜ και προσδέθηκε στο κέντρο αναστολής του ενζύμου. Η πελαργονιδίνη, που ανήκει στην κατηγορία των ανθοκυανιδινών, βρέθηκε προσδεδεμένη στο κέντρο πρόσδεσης κερσετίνης της GP με τιμή Ki 31,8 μΜ. Από τους αναστολείς που μελετήθηκαν και προσδέθηκαν στο αλλοστερικό κέντρο του ενζύμου, ο πλέον ισχυρός ήταν ο G02 με τιμή Ki 5,8 μΜ. Η δεύτερη ομάδα αναστολέων που αξιολογήθηκε η ανασταλτική τους δράση στη GP ήταν μια συλλογή 10 πολυαρωματικών ενώσεων. Ο πιο ισχυρός αναστολέας ήταν ο PA7 (Ki = 7,87 μΜ) και βρέθηκε ότι προσδένεται στο νέο αλλοστερικό κέντρο της GP. Τo άμυλο που παράγεται από τα ανώτερα φυτά λειτουργεί ως θέση αποθήκευσης υδατανθράκων και είναι σημαντική διατροφική πηγή ενέργειας για τον άνθρωπο. Συντίθεται μέσα σε εξειδικευμένα υποκυτταρικά οργανίδια στα φυτικά κύτταρα που ονομάζονται πλαστίδια και η φωσφορολυτική αποικοδόμηση του καταλύεται από τις φωσφορυλάσες του αμύλου (SP). Μέχρι σήμερα λίγα είναι γνωστά για τις πλαστιδιακές φωσφορυλάσες του αμύλου (Pho1). Στο πλαίσιο της διατριβής διεξήχθη βιοχημική ανάλυση της Pho1 από το φυτό Solanum tuberosum (stPho1) και προσδιορίστηκε η κρυσταλλική δομή της stPho1ΔL78, μια μορφή της stPho1 η οποία αποτελείται από δύο επικράτειες που έχουν προκύψει μετά από πρωτεόλυση ενός πεπτιδίου μήκους περίπου 65 καταλοίπων (L78) που βρίσκεται στο κέντρο της πρωτοταγούς δομής της stPho1. Οι κινητικές μελέτες αποκάλυψαν ότι η stPho1ΔL78 είναι 1,5 φορές πιο ενεργή από την stPho1, ενώ παρουσιάζει μεγαλύτερη συγγένεια για το γλυκογόνο, την α-D-γλυκόζη, την καφεΐνη και τη β-κυκλοδεξτρίνη από το φυσικό ένζυμο. Η κρυσταλλική δομή της stPho1ΔL78 προσδιορίστηκε σε ευκρίνεια 2.2 Å, αποκαλύπτοντας ομοιότητες και διαφορές με το ομόλογο ένζυμο των θηλαστικών, που σχετίζονται με τις διαφορετικές εξελικτικές οδούς των φωσφορυλασών των φυτών και των ζωικών οργανισμών. Το καταλυτικό κέντρο και το νέο αλλοστερικό κέντρο είναι συντηρημένα ανάμεσα στα δύο ένζυμα. Ωστόσο, εντοπίζονται διαφορές στο κέντρο αναστολής, στο κέντρο αποθήκευσης του γλυκογόνου, στο αλλοστερικό κέντρο και στο κέντρο κερσετίνης. Η πρόσδεση στην stPho1 της α-D-γλυκόζη, της καφεΐνης και της β-κυκλοδεξτρίνης μελετήθηκε με κρυσταλλογραφία ακτίνων-Χ και αποκάλυψε σημαντικές διαφορές με το ομόλογο ένζυμο των θηλαστικών. Καθώς η stPho1 καταλύει τόσο τη σύνθεση όσο και την αποικοδόμηση του αμύλου, οι κινητικές μελέτες και οι κρυσταλλικές δομές υπέδειξαν ότι η κατεύθυνση της αντίδρασης, μετά την πρωτεολυτική απομάκρυνση της περιοχής L78, είναι προς την αποικοδόμηση του αμύλου. Αυτή είναι η πρώτη φορά που πραγματοποιείται λεπτομερής βιοχημικός και δομικός χαρακτηρισμός μίας φωσφορυλάσης από φυτό και μπορεί να αποτελέσει το σημείο εκκίνησης για περαιτέρω μελέτες στις φυτικές φωσφορυλάσες.