Επίδραση λειτουργικών τροφίμων στην εντερική μικροβιακή χλωρίδα πληθυσμών με μεταβολικά νοσήματα

Abstract

Diet is an important factor that affects the composition of the intestinal microbial flora and can be used as a tool to maintain the gut microbial balance in several metabolic diseases, such as Type 1 Diabetes Mellitus (T1DM). Today, an increased interest on the development of novel foods enriched with functional ingredients of pro- and prebiotics like lactic acid bacteria (LAB) and dietary fibers, is witnessed. Pro- and prebiotics can be utilized to maintain the gut microbiome (GM) balance, conferring beneficial effects in certain diseases. The health-promoting effects of probiotics are strain- rather species-specific, whereas a variety of wild-type strains isolated from various sources (e.g., fermented foods, plant sources, or human samples) are currently being evaluated for their potential positive effects in health aiming at industrial and commercial exploitation. One of the features that functional cultures should exhibit is resistance to the conditions prevailing in the gastrointestinal tract (GIT), in order to survive the digestion process and be able to colonize the intestinal epithelium. The strategy that will be employed to incorporate functional cultures into food systems to achieve the necessary high concentration, especially at the time of consumption, is crucial. It is known that cell immobilization on natural supports, e.g., food ingredients and their use in food production consists of a scientific and technological challenge for the food industry and also significantly improves the viability of cultures. The main purpose of this doctoral thesis was the design and development of functional food ingredients and final products that could confer health effects through the regulation of the intestinal microbiome, focusing on T1DM. In order to fulfill the above objective: a) the potential effects of pistachio consumption (used as a natural food ingredient) on GM in healthy animals and in T1DM animal models were investigated, b) cell immobilization of wild-type LAB strains on natural food ingredients (zea flakes, pistachio and raisin) was optimized, c) the effect of freeze-drying and storage at ambient or refrigerated temperature on the viability of the cultures was studied, aiming at industrial applications, d) the survival rate of the cultures on a static in vitro model, mimicking gastrointestinal (GI) digestion was determined, e) the suitability of freeze-dried immobilized Pediococcus acidilactici SK cells on natural food ingredients in the production of muesli-type breakfast cereals was assessed and f) the potential effects of the consumption of free or immobilized P. acidilactici SK cells on pistachio on GM of healthy animals and T1DM animal models was investigated.Specifically, the effect of pistachio (Pistacia vera L.) dietary intervention on the adherent microbial populations of the jejunum, ileum, colon and cecum and the microbial populations in fecal samples were determined in streptozotocin (STZ)-induced T1DM rats. Fecal and intestinal samples were subjected to microbiological analysis and the levels of total mesophilic flora, enterococci, coliforms, enterobacteria, staphylococci, Escherichia coli, yeasts/fungi, lactobacilli and bifidobacteria were explored. In addition, the relative abundance of the bacterial populations after next-generation sequencing (NGS) using the 16S rRNA gene and the concentrations of short-chain fatty acids (SCFAs) and lactic acid, in fecal samples, were determined. To induce T1DM, the animal models were subjected to intraperitoneal injection of STZ and were divided into 4 groups (6 animals / group): a) healthy animals which received the control diet or b) the pistachio diet, and c) diabetic animals, which received the control or d) the pistachio diet. The duration of the study was 4 weeks and euthanasia was performed at the end to collect the intestinal segments. The results revealed that the pistachio supplementation in T1DM animals led to an increase in bifidobacteria and lactobacilli levels in jejunum, ileum and colon and to a balanced intestinal microbiota in all the examined intestinal segments. A significant increase in lactobacilli and bifidobacteria populations was witnessed in both diabetic and healthy animals, while enterococci counts were decreased after pistachio consumption in both groups in the stool samples. Additionally, the results of the NGS analysis revealed that the pistachio diet led to an increase in Bifidobacterium genus in STZ-induced diabetic rats and Lactobacillus genus in healthy animals. Furthermore, there was a significant increase in Firmicutes and a decrease in Bacteroidetes in healthy pistachio-supplemented animals and an increase in Actinobacteria in diabetic animals. Moreover, consumption of pistachio resulted in decreased levels of isovaleric acid in both healthy and diabetic rats compared to the control groups that received the control diet. Lactic acid was increased in diabetic groups compared to healthy animals (1.429-1.508 and 0.760-0.798 μmol / g, respectively), while its concentration in healthy animals was increased (1.345 μmol / g) compared to baseline values (0.760 μmol / g), after 4 weeks of pistachio consumption. The next step involved the design and development of novel functional food ingredients, as well as final products containing adequate concentrations of live functional LAB cultures. The production of foods enriched with probiotic cultures that will have an increased shelf life and ensure sufficient cell loads of functional cultures at the time of consumption, is a challenge for the food industry. Freeze-drying is the most commonly used technique for dehydrating functional cultures. P. acidilactici SK and Lactiplantibacillus plantarum F4 were used as presumptive probiotic strains and were selected after in vitro evaluation of their probiotic properties, during the research project entitled "Innovative Functional Foods: Development, Production, Characterization, Properties-iFUNFoods" and as a reference (control) strain L. plantarum B282 was used, isolated from table olives and kindly provided by the Institute of Technology of Agricultural Products, ELGO-DIMITRA (Lykovrysi, Greece). Initially, immobilization of probiotic cells in natural food ingredients (zea flakes, pistachio and raisin) was examined and the optimization of the immobilization parameters was studied, aiming at achieving the maximum cell loads of the immobilized cells. At the same time, the effect of freeze-drying (used as a drying method) on the viability of immobilized cells was assessed. Immobilization resulted in high cell concentrations (≥ 8.20 logcfu / g for wet and ≥ 7.35 logcfu / g for freeze-dried cultures). As a next step, the effect of storage at room (18-20° C) or refrigerator (4° C) temperature on the viability of wet or freeze-dried free and immobilized cells was monitored. The levels of freeze-dried cultures were maintained up to 7.17 logcfu / g after 6 months of storage at room temperature and up to 8.47 logcfu / g at refrigerator temperature, in contrast to reduced levels of free cells that ranged from 3.13 and 8.05 logcfu / mL, respectively, indicating the advantage of immobilization and freeze-drying on cell viability. All forms (freeze-dried or wet and immobilized or free) of the functional food ingredients containing were assessed according to a static in vitro model of gastrointestinal digestion to evaluate their ability of the strains to survive passage through the GIT, which is an important attribute. Incubation in oral cavity-simulation solution had no significant effect on the survival rate, regardless of the condition (wet or freeze-dried) or nature (free or immobilized) of the cells. However, after the in vitro digestion simulation and incubation in the stomach- and intestine-simulation solutions, significantly higher survival rates were observed in the immobilized compared to the free cells, while significant differences were noted among the wet and freeze-dried cells, in specific cases. The immobilization carrier significantly affected cell survival and the highest percentages were documented in the immobilized cells in zea flakes or pistachio. The highest survival rates recorded for each strain were 95.91% for freeze-dried immobilized cells of L. plantarum F4 on zea flakes, 91.97% for freeze-dried immobilized cells of P. acidilactici SK on zea flakes, and 90.17-93.47% for freeze-dried immobilized cells of L. plantarum B282 on zea flakes / pistachio. The freeze-dried immobilized P. acidilactici SK cells were then tested as functional food ingredients in muesli-type breakfast cereals production and the effect of storage temperature on cell viability was studied, while the new products were subjected to preliminary sensory evaluation. At the day of production, a high cell concentration was achieved (8.73 logcfu / g), which significantly decreased after 30 and 90 days of storage at room (8.57 logcfu / g) and refrigerator temperature (8.48 logcfu / g), respectively. After 6 months of storage, the survival rates were 92.33% at room temperature and 94.96% at refrigerator temperature. Muesli-type breakfast cereals received positive evaluations during the sensory test and no significant differences were observed in the when compared to cereals that contained no immobilized cultures. As a following step, an in vivo dietary intervention with freeze-dried free or immobilized P. acidilactici SK cells on pistachio in T1DM animal models was performed. The animals consumed 2*109 cfu cells daily, and the duration of the study was 30 days. At the end, euthanasia was performed and intestinal tissue segments and blood samples were collected. Adherent microbial populations in the intestinal segments (jejunum, ileum, colon, cecum) and in fecal samples were determined, followed by NGS analysis of the fecal samples and quantification of SCFAs and lactic acid, while biochemical parameters and levels of insulin and inflammatory factors in blood plasma samples were also examined. The results of microbiological analyses in the intestinal segments of the ileum and colon of diabetic animal models revealed reduced levels of Enterobacteriaceae after consumption of immobilized P. acidilactici SK cells on pistachio, compared to the groups that consumed the free cells (3.87 and 3.30 logcfu / g, compared to 4.09 and 4.76 logcfu / g, for ileum and colon, respectively). After 4 weeks, the populations of fecal lactobacilli increased in all groups (healthy and diabetic animals), indicating the survival of the administered strain, while bifidobacteria increased in healthy animal models that received the immobilized cells on pistachio. Moreover, the populations of opportunistic pathogens were decreased compared to baseline or rendered to the levels of healthy animals after administration of free or immobilized P. acidilactici SK cells. The NGS analysis revealed an increased abundance of the phylum Actinobacteria in diabetic animal groups and a further increase in animals receiving immobilized P. acidilactici SK cells, after 4 weeks. At the genus level, Pediococcus spp. increased in all groups, while the relative abundance of the genus Lactobacillus was increased in the groups that received the immobilized cells. The dietary intervention had no effect on the levels of SCFAs and lactic acid. In addition, consumption of free or immobilized P. acidilactici SK resulted in significantly increased plasma HDL-c levels in STZ-induced diabetic animal models, compared to baseline values and in similar levels to healthy animals, but without affecting glucose or insulin levels. Furthermore, multiplex PCR using species-specific primers for P. acidilactici was used to confirm the presence of the strain at concentrations > 6 logcfu / g in the intestinal segments and fecal samples. Taking into consideration the above results, the positive effect of a diet enriched with functional foods containing presumptive probiotic microorganisms on health and in T1DM is highlighted. Pistachio, a nut that is part of the Mediterranean diet, can have a positive effect on the GM of STZ-induced T1DM animal models. At the same time, the immobilization of functional cultures on pistachio and zea flakes had a positive effect on cell viability during storage and in conditions simulating gastrointestinal digestion. Finally, the dietary intervention with free or immobilized P. acidilactici SK cultures had a positive effect on the GM of T1DM animal models and on their blood lipid profile. Thus, freeze-dried immobilized cells on natural food ingredients is expected to have a high industrial and commercial potential in the food industry.

Η διατροφή, αποτελεί σημαντικό παράγοντα που επηρεάζει τη σύσταση της μικροβιακής χλωρίδας του εντέρου και μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως εργαλείο για την διατήρηση της εντερικής μικροβιακής ισορροπίας σε πλήθος μεταβολικών νοσημάτων και κατ’ επέκταση και σε καταστάσεις Σακχαρώδους Διαβήτη τύπου 1 (ΣΔτ1). Σήμερα, παρατηρείται έντονο ενδιαφέρον για την ανάπτυξη νέων τροφίμων εμπλουτισμένων με προ- και πρεβιοτικά συστατικά, όπως βακτήρια του γαλακτικού οξέος (LAB) και διαιτητικές ίνες, τα οποία μπορούν να αξιοποιηθούν για την ομοιόσταση του εντερικού μικροβιώματος (ΕΜ) με ευεργετικά αποτελέσματα σε ορισμένες ασθένειες. Οι ωφέλιμες επιδράσεις των προβιοτικών είναι συγκεκριμένες για κάθε στέλεχος και όχι χαρακτηριστικές για συγκεκριμένα είδη, ενώ πλήθος αγρίου-τύπου στελεχών απομονωμένα από διάφορες πηγές (π. χ. ζυμωμένα τρόφιμα, φυτικές πηγές ή ανθρώπινα δείγματα μικροβιώματος) αξιολογούνται ως προς τις πιθανές τους ευεργετικές δράσεις στην υγειά με στόχο την βιομηχανική και εμπορική αξιοποίησή τους. Ένα χαρακτηριστικό που πρέπει να παρουσιάζουν οι λειτουργικές καλλιέργειες είναι ανθεκτικότητα στις συνθήκες που επικρατούν κατά μήκος του γαστρεντερικού σωλήνα (ΓΣ), έτσι ώστε να μπορούν να επιβιώσουν κατά την πέψη και να έχουν ικανότητα αποικισμού στον εντερικό σωλήνα. Η στρατηγική που θα εφαρμοστεί για την ενσωμάτωση των λειτουργικών καλλιεργειών στα τρόφιμα αποτελεί καθοριστικό παράγοντα για να επιτευχθεί η αναγκαία υψηλή συγκέντρωση, ειδικά κατά τη στιγμή της κατανάλωσης. Είναι, επίσης, γνωστό πως η ακινητοποίηση των κυττάρων, π. χ. σε διατροφικά συστατικά τροφίμων και η χρήση τους στην παραγωγή (τελικών) προϊόντων τροφίμων, αποτελεί σήμερα επιστημονική και τεχνολογική πρόκληση για τη βιομηχανία και παράλληλα βελτιώνει σημαντικά τη ζωτικότητα των καλλιεργειών. Ο βασικός σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν ο σχεδιασμός και η ανάπτυξη λειτουργικών συστατικών τροφίμων και τελικών προϊόντων με θετικές στην υγεία δράσεις μέσω της δυνατότητας ρύθμισης της εντερικής μικροβιακής χλωρίδας, εστιάζοντας στον ΣΔτ1. Προκειμένου να υλοποιηθεί ο παραπάνω σκοπός: α) διερευνήθηκαν, in vivo, οι πιθανές επιδράσεις στο ΕΜ της κατανάλωσης κελυφωτού φιστικιού σε υγιή ζωικά πρότυπα και σε ζωικά πρότυπα ΣΔτ1, στοχεύοντας στη χρήση του ως λειτουργικού φορέα ακινητοποίησης, β) μελετήθηκε η ακινητοποίηση αγρίου-τύπου στελεχών LAB σε φυσικούς φορείς (νιφάδες ζέας, κελυφωτό φιστίκι και σταφίδα), γ) μελετήθηκε η επίδραση της λυοφιλίωσης και της θερμοκρασίας αποθήκευσης στη βιωσιμότητα των καλλιεργειών, με σκοπό την ικανοποίηση των απαιτήσεων της βιομηχανίας, δ) προσδιορίστηκε το ποσοστό επιβίωσης των καλλιεργειών σε στατικό in vitro μοντέλο γαστρεντερικής πέψης, ε) αξιολογήθηκε η καταλληλόλητα ξηρών ακινητοποιημένων κυττάρων Pediococcus acidilactici SK σε φυσικούς φορείς στην παραγωγή δημητριακών πρωινού τύπου muesli και στ) διερευνήθηκαν, in vivo, οι πιθανές επιδράσεις στο ΕΜ της κατανάλωσης ελεύθερων ή ακινητοποιημένων κυττάρων σε κελυφωτό φιστίκι σε υγιή ζωικά πρότυπα και σε ζωικά πρότυπα ΣΔτ1.Αρχικά διερευνήθηκε η επίδραση της διατροφικής παρέμβασης με κελυφωτό φιστίκι (Pistacia vera L.) στους προσκολλημένους στο εντερικό επιθήλιο μικροβιακούς πληθυσμούς στα εντερικά τμήματα της νήστιδας, του ειλεού, του κόλου και του τυφλού, αλλά και των μικροβιακών πληθυσμών σε δείγματα κοπράνων επίμυων με ΣΔτ1. Στα δείγματα προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της ολικής μεσόφιλης χλωρίδας, καθώς και των εντερόκοκκων, κολοβακτηρίων, εντεροβακτηρίων, σταφυλόκοκκων, Ε. coli, ζυμών / μυκήτων, γαλακτικών βακτηρίων και bifidobacteria. Επιπλέον, προσδιορίστηκε η σχετική αφθονία των βακτηριακών πληθυσμών με αλληλούχιση νέας γενιάς (NGS) και του γονιδίου 16S rRNA και του προφίλ λιπαρών οξέων βραχείας αλυσίδας (SCFAs) και του γαλακτικού οξέος σε δείγματα κοπράνων. Τα ζωικά μοντέλα, αφού κατέστησαν διαβητικά μετά από ενδοπεριτοναϊκή ένεση στρεπτοζοτοκίνης, χωρίστηκαν σε 4 ομάδες των 6 ζώων / ομάδα: α) υγιή ζώα που έλαβαν συμβατική τροφή, β) υγιή ζώα στα οποία εφαρμόστηκε διατροφική παρέμβαση με κελυφωτό φιστίκι, γ) ζώα με ΣΔτ1 που έλαβαν συμβατική τροφή και δ) ζώα με ΣΔτ1 που τράφηκαν με κελυφωτό φιστίκι. Η διάρκεια της παρέμβασης ήταν 4 εβδομάδες και στο τέλος πραγματοποιήθηκε ευθανασία, έτσι ώστε να συλλεχθούν τα εντερικά τμήματα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η διατροφή των διαβητικών ζώων με κελυφωτό φιστίκι οδήγησε σε αύξηση των bifidobacteria και των γαλακτικών βακτηρίων στη νήστιδα, στον ειλεό και στο κόλον και οδήγησε σε εξισορρόπηση της εντερικής μικροβιακής χλωρίδας σε όλα τα υπό εξέταση εντερικά τμήματα. Τα γαλακτικά βακτήρια και τα bifidobacteria εμφάνισαν στατιστικά σημαντική αύξηση τόσο στα διαβητικά όσο και στα υγιή ζωικά πρότυπα, ενώ οι εντερόκοκκοι φαίνεται να μειώθηκαν μετά τη διατροφή με κελυφωτό φιστίκι και στις 2 παραπάνω ομάδες στα δείγματα κοπράνων. Επιπλέον, μετά την ανάλυση NGS τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η διατροφή με κελυφωτό φιστίκι οδήγησε σε αύξηση του γένους Bifidobacterium στους επίμυες που κατέστησαν διαβητικοί μετά από χορήγηση στρεπτοζοτοκίνης και του γένους Lactobacillus στα υγιή ζωικά πρότυπα. Ακόμη, παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση των Firmicutes και μείωση των Bacteroidetes στα υγιή ζώα που τράφηκαν με φιστίκι, αλλά και αύξηση των Actinobacteria στα διαβητικά ζωικά πρότυπα. Επίσης, η κατανάλωση κελυφωτού φιστικιού οδήγησε σε μειωμένα επίπεδα ισοβαλερικού οξέος τόσο σε υγιείς όσο και σε διαβητικούς επίμυες σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου που έλαβαν συμβατική δίαιτα. Το γαλακτικό οξύ βρέθηκε αυξημένο στις διαβητικές ομάδες ζώων συγκριτικά με τις υγιείς (1.429-1.508 και 0.760-0.798 μmol / g, αντίστοιχα), ενώ η συγκέντρωσή του στα υγιή ζωικά πρότυπα μετά από 4 εβδομάδες κατανάλωσης κελυφωτού φιστικιού αυξήθηκε (1.345 μmol / g) συγκριτικά με την έναρξη της παρέμβασης (0.760 μmol / g).Σε επόμενο στάδιο, πραγματοποιήθηκε σχεδιασμός και ανάπτυξη καινοτόμων λειτουργικών συστατικών τροφίμων, αλλά και τελικών προϊόντων, με στόχο τη διατήρηση υψηλής συγκέντρωσης ζωντανών λειτουργικών καλλιεργειών LAB. Η παραγωγή τροφίμων με προβιοτικές καλλιέργειες που θα έχουν αυξημένη διάρκεια ζωής και ταυτόχρονα υψηλή συγκέντρωση τη στιγμή της κατανάλωσης, αποτελεί προϋπόθεση για τη βιομηχανία. Η ξήρανση με ψύξη και υπό κενό (λυοφιλίωση) είναι η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη τεχνική για την αφυδάτωση λειτουργικών καλλιεργειών. Ως δυνητικά προβιοτικά στελέχη χρησιμοποιήθηκαν τα P. acidilactici SK και Lactiplantibacillus plantarum F4, απομονωμένα από κόπρανα εθελοντών και από ξηρά σύκα, αντίστοιχα, τα οποία επιλέχθηκαν μετά από in vitro αξιολόγηση των προβιοτικών τους ιδιοτήτων, στα πλαίσια του ερευνητικού έργου «Καινοτόμα Λειτουργικά Τρόφιμα: Ανάπτυξη, Παραγωγή, Χαρακτηρισμός, Ιδιότητες‐iFUNFoods», και ως στέλεχος αναφοράς χρησιμοποιήθηκε το L. plantarum Β282, απομονωμένο από επιτραπέζιες ελιές, το οποίο ήταν ευγενική παραχώρηση του Ινστιτούτου Τεχνολογίας Αγροτικών Προϊόντων, ΕΛΓΟ-ΔΗΜΗΤΡΑ (Λυκόβρυση, Ελλάδα). Αρχικά, εξετάστηκε η δυνατότητα ακινητοποίησης των προβιοτικών κυττάρων σε φυσικούς φορείς (νιφάδες ζέας, κελυφωτό φιστίκι και σταφίδα) και μελετήθηκε η βελτιστοποίηση των παραμέτρων ακινητοποίησης, με στόχο την επίτευξη των μεγίστων επιπέδων ακινητοποιημένων κυττάρων. Παράλληλα, μελετήθηκε η επίδραση της λυοφιλίωσης ως μεθόδου ξήρανσης στη βιωσιμότητα ακινητοποιημένων κυττάρων. Η ακινητοποίηση οδήγησε σε υψηλή κυτταρική συγκέντρωση (≥ 8.20 logcfu / g για υγρές και ≥ 7.35 logcfu / g για λυοφιλιωμένες καλλιέργειες). Στη συνέχεια, μελετήθηκε η επίδραση της αποθήκευσης σε θερμοκρασία δωματίου (18-20°C) ή ψυγείου (4°C) στη βιωσιμότητα υγρών ή λυοφιλιωμένων ελεύθερων και ακινητοποιημένων κυττάρων. Τα επίπεδα των λυοφιλιωμένων καλλιεργειών διατηρήθηκαν έως 7.17 logcfu / g μετά από αποθήκευση 6 μηνών σε θερμοκρασία δωματίου και έως 8.47 logcfu / g σε θερμοκρασία ψυγείου, σε αντίθεση με τα επίπεδα των ελευθέρων κυττάρων που κυμάνθηκαν 3.13 και 8.05 logcfu / mL, αντίστοιχα, υποδεικνύοντας τα πλεονεκτήματα που προσέφερε η ακινητοποίηση και η λυοφιλίωση στην κυτταρική βιωσιμότητα.Τα λειτουργικά συστατικά τροφίμων των 3 υπό μελέτη στελεχών σε όλες τις μορφές (λυοφιλιωμένα ή υγρά και ακινητοποιημένα ή ελεύθερα) υποβλήθηκαν σε στατικό in vitro μοντέλο γαστρεντερικής πέψης προκειμένου να αξιολογηθεί η ικανότητα επιβίωσής τους κατά την δίοδο από το ΓΣ που αποτελεί ένα σημαντικό κριτήριο επιλογής των λειτουργικών καλλιεργειών. Η επώαση στο διάλυμα προσομοίωσης στοματικής κοιλότητας δεν επηρέασε σημαντικά το ποσοστό επιβίωσης ανεξάρτητα από την κατάσταση (υγρές ή λυοφιλιωμένες) ή την φύση (ελεύθερες ή ακινητοποιημένες) των κυττάρων. Όμως, μετά την ολοκλήρωση της in vitro προσομοίωσης πέψης και την επώαση στα διαλύματα προσομοίωσης στομάχου και εντέρου, παρατηρήθηκαν σημαντικά υψηλότερα ποσοστά επιβίωσης στα ακινητοποιημένα σε σχέση με τα ελεύθερα κύτταρα, ενώ μεταξύ υγρών και λυοφιλιωμένων κυττάρων εμφανίστηκαν διαφορές σε συγκεκριμένες περιπτώσεις. Αξίζει να αναφερθεί πως καταγράφηκαν σημαντικές διαφορές ανάλογα με τον φορέα ακινητοποίησης, όπου τα υψηλότερα ποσοστά εμφανίστηκαν στα ακινητοποιημένα κύτταρα σε νιφάδες ζέας ή σε κελυφωτό φιστίκι. Tα υψηλότερα ποσοστά επιβίωσης για κάθε στέλεχος ήταν: 95.91% για τα λυοφιλιωμένα ακινητοποιημένα κύτταρα L. plantarum F4 σε νιφάδες ζέας, 91.97% για τα λυοφιλιωμένα ακινητοποιημένα κύτταρα P. acidilactici SK σε νιφάδες ζέας και 90.17-93.47% για τα λυοφιλιωμένα κύτταρα L. plantarum Β282 σε νιφάδες ζέας / κελυφωτό φιστίκι. Τα συστατικά τροφίμων με τις ξηρές ακινητοποιημένες καλλιέργειες P. acidilactici SK στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν για την παραγωγή δημητριακών τύπου muesli και μελετήθηκε η επίδραση της θερμοκρασίας αποθήκευσης στην κυτταρική βιωσιμότητα, ενώ παράλληλα τα νέα προϊόντα υποβλήθηκαν σε οργανοληπτική αξιολόγηση από κοινούς καταναλωτές. Την ημέρα παραγωγής επιτεύχθηκε υψηλή συγκέντρωση κυττάρων (8.73 logcfu / g), η οποία μειώθηκε σημαντικά μετά από 30 και 90 ημέρες αποθήκευσης σε θερμοκρασία δωματίου (8.57 logcfu / g) και ψυγείου (8.48 logcfu / g), αντίστοιχα. Μετά από 6 μήνες αποθήκευσης, τα ποσοστά επιβίωσης κυμάνθηκαν 92.33% σε θερμοκρασία δωματίου και 94.96% σε θερμοκρασία ψυγείου και οι αντίστοιχες τιμές ενεργότητας νερού ήταν 0.125 και 0.098. Τα δημητριακά πρωινού απέσπασαν θετικές βαθμολογίες κατά την οργανοληπτική αξιολόγηση και δεν διαφοροποιήθηκαν σε σχέση με τα δημητριακά που δεν περιείχαν ακινητοποιημένες καλλιέργειες. Ακολούθησε in vivo διατροφική παρέμβαση με ξηρές ακινητοποιημένες καλλιέργειες P. acidilactici SK σε κελυφωτό φιστίκι ή ελεύθερα κύτταρα σε ζωικά πρότυπα ΣΔτ1. Οι επίμυες κατανάλωναν καθημερινά 2*10^9 cfu κυττάρων και η διάρκεια του πειραματικού πρωτοκόλλου ήταν 30 ημέρες. Στο τέλος, πραγματοποιήθηκε ευθανασία και συλλογή εντερικού ιστού και ολικού αίματος και προσδιορίστηκαν τα επίπεδα των προσκολλημένων στα διάφορα εντερικά τμήματα (νήστιδα, ειλεός, κόλον, τυφλό) και σε δείγματα κοπράνων μικροβιακών πληθυσμών. Ακολούθησε ανάλυση NGS σε δείγματα κοπράνων και ποσοτικοποίηση των SCFAs και γαλακτικού οξέος, ενώ επίσης εξετάστηκαν οι βιοχημικές παράμετροι και τα επίπεδα ινσουλίνης και παραγόντων φλεγμονής στο αίμα των ζώων. Τα αποτελέσματα των μικροβιολογικών αναλύσεων στα εντερικά τμήματα του ειλεού και στο κόλον των διαβητικών ζωικών προτύπων φανερώνουν μειωμένα επίπεδα εντεροβακτηρίων μετά την κατανάλωση ακινητοποιημένων κυττάρων P. acidilactici SK σε κελυφωτό φιστίκι, συγκριτικά με τις ομάδες που κατανάλωσαν τα ελεύθερα κύτταρα (3.30 και 3.87 logcfu / g, συγκριτικά με 4.09 και 4.76 logcfu / g, για ειλεό και κόλον, αντίστοιχα). Μετά από 4 εβδομάδες, οι πληθυσμοί των γαλακτικών βακτηρίων στα κόπρανα αυξήθηκαν σε όλες τις ομάδες, υποδεικνύοντας την επιβίωση του χορηγούμενου στελέχους που ανήκει στα LAB, ενώ τα bifidobacteria αυξήθηκαν σε υγιή ζωικά πρότυπα που έλαβαν τα ακινητοποιημένα κύτταρα σε κελυφωτό φιστίκι. Παράλληλα, στα ζωικά πρότυπα ΣΔτ1, οι πληθυσμοί δυνητικά παθογόνων μικροβίων μειώθηκαν (συγκριτικά με την έναρξη της παρέμβασης) ή επανήλθαν στα επίπεδα των υγιών ζώων μετά την χορήγηση ελεύθερων ή ακινητοποιημένων κυττάρων P. acidilactici SK. Μετά την NGS ανάλυση, εντοπίστηκε αυξημένη παρουσία του φύλου Actinobacteria στα διαβητικά ζωικά πρότυπα και περαιτέρω αύξηση στα ζώα που έλαβαν ακινητοποιημένα κύτταρα P. acidilactici SK. Σε επίπεδο γένους, το Pediococcus spp. αυξήθηκε σε όλες τις ομάδες ζωικών προτύπων, ενώ το γένος Lactobacillus αυξήθηκε στις ομάδες που έλαβαν τα ακινητοποιημένα κύτταρα. Η διατροφική παρέμβαση δεν επηρέασε τα επίπεδα των SCFAs και του γαλακτικού οξέος. Επιπρόσθετα, η κατανάλωση (ελεύθερων ή ακινητοποιημένων) κυττάρων P. acidilactici SK οδήγησε σε σημαντικά αυξημένα επίπεδα HDL-c στο πλάσμα των διαβητικών ζωικών προτύπων, συγκριτικά με την έναρξη της παρέμβασης και σε παρόμοια επίπεδα με των υγιών ζώων, χωρίς, όμως, να επιδρά στα επίπεδα γλυκόζης ή ινσουλίνης. Τελικά, με την χρήση multiplex PCR ειδικής για τo είδος P. acidilactici επιβεβαιώθηκε η παρουσία του σε συγκεντρώσεις > 6 logcfu / g στα δείγματα του εντερικού ιστού και κοπράνων.Λαμβάνοντας υπόψιν τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής υπογραμμίζεται η θετική επίδραση της διατροφής ή / και των λειτουργικών τροφίμων που περιέχουν δυνητικά προβιοτικούς μικροοργανισμούς στην υγεία και στον ΣΔτ1. Το κελυφωτό φιστίκι που αποτελεί έναν ξηρό καρπό που εντάσσεται στη μεσογειακή διατροφή μπορεί να επιδρά θετικά στο ΕΜ ζωικών προτύπων ΣΔτ1. Παράλληλα, η ακινητοποίηση λειτουργικών καλλιεργειών σε κελυφωτό φιστίκι και νιφάδες ζέας είχε θετική επίδραση στην κυτταρική βιωσιμότητα, τόσο κατά την αποθήκευση, αλλά και κατά την επώαση σε συνθήκες προσομοίωσης γαστρεντερικής πέψης. Τα ξηρά ακινητοποιημένα κύτταρα σε φυσικούς φορείς παρουσιάζουν προοπτικές εφαρμογής σε συστήματα τροφίμων ως λειτουργικά συστατικά τροφίμων και αναμένεται να προσελκύσουν το καταναλωτικό κοινό. Τέλος, η διατροφική παρέμβαση με λειτουργικές καλλιέργειες P. acidilactici SK σε ελεύθερη ή ακινητοποιημένη μορφή επιδρά θετικά στο ΕΜ ζωικών προτύπων ΣΔτ1, αλλά και στο προφίλ των λιπιδίων του αίματος.