Περίληψη
Η βιοπληροφορική ανάλυση που βασίζεται σε αλληλουχίες είναι εδώ και πολύ καιρό η κινητήρια δύναμη των εξελικτικών μελετών, ενώ οι πειραματικές προσεγγίσεις προσφέρουν νέες ιδέες μέσω της μεταλλαξιογένεσης, της in vivo και της in vitro εξέλιξης. Εδώ, χρησιμοποιούμε και τις δύο προσεγγίσεις για να φωτίσουμε πτυχές της εξέλιξης δύο διαφορετικών οικογενειών πρωτεϊνών, της οικογένειας πρωτεϊνών mempromCC και της οικογένειας πρωτεϊνών κινάσης της ιστιδίνης. Η οικογένεια mempromCC περιλαμβάνει πρωτεΐνες με δομή περιελιγμένου πηνίου-συνδεδεμένου με μεμβράνη, οι οποίες βρίσκονται κυρίως στα μιτοχόνδρια. Η βιοπληροφορική μας ανάλυση, για πρώτη φορά, επιτρέπει τη συλλογική δομική και λειτουργική τους ανάλυση των πρωτεϊνών της οικογένειας mempromCC. Παράλληλα, ενώ ο μηχανισμός της λειτουργίας παραμένει αδιευκρίνιστος, αυτές οι πρωτεΐνες έχει αποδειχθεί ότι δρουν ως παράγοντες συναρμολόγησης διαφορετικών πρωτεϊνών όπως ο μιτοχονδριακός Ca2+ uniporter (MCU), το κυτόχρωμα c και το Photosystem I, που ...
Η βιοπληροφορική ανάλυση που βασίζεται σε αλληλουχίες είναι εδώ και πολύ καιρό η κινητήρια δύναμη των εξελικτικών μελετών, ενώ οι πειραματικές προσεγγίσεις προσφέρουν νέες ιδέες μέσω της μεταλλαξιογένεσης, της in vivo και της in vitro εξέλιξης. Εδώ, χρησιμοποιούμε και τις δύο προσεγγίσεις για να φωτίσουμε πτυχές της εξέλιξης δύο διαφορετικών οικογενειών πρωτεϊνών, της οικογένειας πρωτεϊνών mempromCC και της οικογένειας πρωτεϊνών κινάσης της ιστιδίνης. Η οικογένεια mempromCC περιλαμβάνει πρωτεΐνες με δομή περιελιγμένου πηνίου-συνδεδεμένου με μεμβράνη, οι οποίες βρίσκονται κυρίως στα μιτοχόνδρια. Η βιοπληροφορική μας ανάλυση, για πρώτη φορά, επιτρέπει τη συλλογική δομική και λειτουργική τους ανάλυση των πρωτεϊνών της οικογένειας mempromCC. Παράλληλα, ενώ ο μηχανισμός της λειτουργίας παραμένει αδιευκρίνιστος, αυτές οι πρωτεΐνες έχει αποδειχθεί ότι δρουν ως παράγοντες συναρμολόγησης διαφορετικών πρωτεϊνών όπως ο μιτοχονδριακός Ca2+ uniporter (MCU), το κυτόχρωμα c και το Photosystem I, που είναιζωτικής σημασίας για την επιβίωση των κυττάρων. Οι πρωτεΐνες κινάσης της ιστιδίνης λειτουργούν τυπικά ως πρωτεΐνες πολλαπλών domain, που περιλαμβάνουν έναν διαμεμβρανικό αισθητήρα και έναν κυτταροπλασματικό τελεστή. Στην οσμορρυθμιστική κινάση ιστιδίνης EnvZ, τα σήματα μεταδίδονται μέσω της DHp (διμερισμός και φωσφομεταφορά ιστιδίνης) και των damain CA (κατάλυση και δέσμευση ATP): Η CA φέρει ATP και φωσφορυλιώνει μια ιστιδίνη στην DHp, η οποίαστη συνέχεια μεταφέρει τη φωσφορική ομάδα σε πρωτεΐνες τελεστές, με αποτέλεσμα τηντροποποιημένη μεταγραφή γονιδίων που ελέγχονται από τον προαγωγέα ompC. Βασισμένοι στα εξελικτικά χαρακτηριστικά που παρατηρήθηκαν τόσο για τη DHp όσο και για τη CA, ένα εξελικτικό σενάριο προέκυψε, σύμφωνα με το οποίο τα δύο domain συγχωνεύτηκαν νωρίς κατά την εξέλιξη της κινάσης της ιστιδίνης. Για να μελετήσουμε αυτήν την πιθανότητα, δημιουργήσαμε μια χίμαιρα, στην οποία η CA αντικαταστάθηκε με τη DX, μια τεχνητή πρωτεΐνη που δημιουργήθηκε μέσω in-vivo εξέλιξης με επιλογή της ιδιότητας δέσμευσης του ΑΤΡ. Πράγματι, μια πρωτεΐνη σύντηξης DHp-DX (DHp-DX1) έδειξε ισχυρή δραστηριότητα ΑΤΡάσης in vitro, αυτό δεν παρατηρήθηκε χρησιμοποιώντας μόνο για τη DX. In vivo, η DHp-DX1 αύξησε τημεταγραφή των ελεγχόμενων με ompC γονιδίων σε σύγκριση με μια μεταλλαγμένη και ανεπαρκή φωσφοτρανσφεράσηDHp-DX1(H15Q). Συλλογικά, αυτά τα ευρήματα υποστηρίζουν την σταδιακή εξέλιξη του διμερούς DHp-CA και προσφέρει μια απόδειξη της θεωρίας για την εξέλιξη ενός αρχέγονου ενζύμου.
περισσότερα
Περίληψη σε άλλη γλώσσα
Sequence-based bioinformatic analysis has long been a driving force of evolutionary studies, while experimental approaches offer new insights through mutagenesis, in vivo and in vitro evolution. Here, we employ both approaches to illuminate aspects of the evolution of two different protein families, the mempromCC protein family and the histidine kinase protein family. The mempromCC family comprises membrane-bound coiled-coil-containing proteins found mostly in mitochondria. Our bioinformatic analysis connects for the first time these proteins allowing their collective structural and functional analysis. While the mechanism of function remains elusive, these proteins have been shown to act as assembling factors of different proteins like the mitochondrial Ca2+ uniporter (MCU), cytochrome c and Photosystem I that are crucial for cell survival. Histidine kinase proteins typically function as multidomain proteins, comprising transmembrane sensor and cytoplasmic effector domains. In the osm ...
Sequence-based bioinformatic analysis has long been a driving force of evolutionary studies, while experimental approaches offer new insights through mutagenesis, in vivo and in vitro evolution. Here, we employ both approaches to illuminate aspects of the evolution of two different protein families, the mempromCC protein family and the histidine kinase protein family. The mempromCC family comprises membrane-bound coiled-coil-containing proteins found mostly in mitochondria. Our bioinformatic analysis connects for the first time these proteins allowing their collective structural and functional analysis. While the mechanism of function remains elusive, these proteins have been shown to act as assembling factors of different proteins like the mitochondrial Ca2+ uniporter (MCU), cytochrome c and Photosystem I that are crucial for cell survival. Histidine kinase proteins typically function as multidomain proteins, comprising transmembrane sensor and cytoplasmic effector domains. In the osmoregulating histidine kinase EnvZ, signals are transmitted through the DHp (dimerization and histidine phosphotransfer) and the CA (catalytic and ATPbinding) domains: CA carries ATP and phosphorylates a histidine in DHp, which then transfers the phosphate group to downstream effectors, resulting in a modulated transcription of genes controlled by the ompC promoter. Based on the evolutionary traits observed for both DHp and CA an evolutionary scenario has emerged, in which the two domains were fused early in evolution building a histidine kinase from a simple ATP-binding element. To study this possibility, we produced a chimera, in which CA was replaced with DX, an artificial protein that was generated through in-vivo evolution by selecting for ATP binding affinity. Indeed, a DHp-DX fusion protein (DHp-DX1) showed a strong ATPase activity invitro, that was not seen for DX alone. In vivo, DHp-DX1 increased the transcription of ompC-controlled genes compared to a phosphotransferasedeficientDHp-DX1(H15Q) mutant. Collectively, these findings support themodular evolution of the DHp-CA element and offer a proof of concept for primordial enzyme evolution.
περισσότερα
Περίληψη σε άλλη γλώσσα
Sequenz-basierte bioinformatische Analysen waren lange die treibende Kraft in Evolutionsstudien, obwohl auch experimentelle Vorgehensweisen durch Mutagenese, in vivo und in vitro Evolution neue Einblicke liefern. In dieser Arbeit wurden beide Vorgehensweisen angewendet, um evolutionäre Aspekte zweier verschiedener Protein-Familien, der mempromCC-Proteine und der Histidinkinasen, genauer zu beleuchten. Die mempromCC-Familie besteht aus membrangebundenen coiled-coil-haltigen Proteinen, welche hauptsächlich in den Mitochondrien zu finden sind. Unsere bioinformatischen Analysen verknüpfen diese Proteine zum ersten Mal und ermöglichen eine gemeinsame strukturelle und funktionelle Analyse der mempromCC-Familie. Obwohl ihr Funktionsmechanismus weiter ungeklärt bleibt, zeigte sich, dass diese Proteine als Assemblierungsfaktoren für verschiedene Proteine dienen, zum Beispiel den mitochondrialen Ca2+ Uniporter (MCU), Cytochrom C und Photosystem I, welche wichtig für das Überleben der Zellen sind ...
Sequenz-basierte bioinformatische Analysen waren lange die treibende Kraft in Evolutionsstudien, obwohl auch experimentelle Vorgehensweisen durch Mutagenese, in vivo und in vitro Evolution neue Einblicke liefern. In dieser Arbeit wurden beide Vorgehensweisen angewendet, um evolutionäre Aspekte zweier verschiedener Protein-Familien, der mempromCC-Proteine und der Histidinkinasen, genauer zu beleuchten. Die mempromCC-Familie besteht aus membrangebundenen coiled-coil-haltigen Proteinen, welche hauptsächlich in den Mitochondrien zu finden sind. Unsere bioinformatischen Analysen verknüpfen diese Proteine zum ersten Mal und ermöglichen eine gemeinsame strukturelle und funktionelle Analyse der mempromCC-Familie. Obwohl ihr Funktionsmechanismus weiter ungeklärt bleibt, zeigte sich, dass diese Proteine als Assemblierungsfaktoren für verschiedene Proteine dienen, zum Beispiel den mitochondrialen Ca2+ Uniporter (MCU), Cytochrom C und Photosystem I, welche wichtig für das Überleben der Zellen sind. Histidinkinasen wirken typischerweise als Multidomänen-Proteine, bestehend aus Transmembran-Sensor- und cytoplasmatischen Effektor-Domänen. In der osmo-regulierenden Histidinkinase EnvZ werden Signale durch die DHp (Dimerisierungs- und Histidin-Phosphorylierungs-domäne) und die CA (katalytische- und ATP-bindende Domäne) Domäne übertragen: CA trägt ATP und phosphoryliert ein Histidin in DHp, welches die Phosphatgruppe dann auf nachgeschaltete Effektoren überträgt. Dies führt in Genen, welche vom OmpC-Promotor reguliert werden, zu einer Transkriptionsänderung. Basierend auf den evolutionären Merkmalen, die sowohl für DHp als auch CA beobachtet wurden, ist ein Evolutions-Szenario entstanden. Die beiden Domänen wurden früh in der Evolution fusioniert und bildeten aus einem einfachen ATPbindenden Element eine Histidinkinase. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, haben wir eine Chimäre hergestellt, in welcher CA durch DX ersetzt wurde. DX ist ein künstliches Protein, das via in vivo-Evolution durch Selektion auf ATPBindeaffinität generiert wurde. Ein DHp-DX-Fusionsprotein (DHp-DX1) zeigte in vitro tatsächlich eine starke ATPase-Aktivität, für DX allein wurde dies nicht beobachtet. In vivo erhöhte DHp-DX1 die Transkription von OmpC-regulierten Genen im Vergleich zu einer Phosphotransferase-defizienten DHp-DX1(H15Q)-Mutante. Zusammenfassend unterstützen diese Entdeckungen die modulare Entwicklung des DHp-CA-Elements und bieten einen Beweis für das Konzept der Ur-Enzymentwicklung.
περισσότερα