Method development for identification of tachykinins and their post-translational modifications and discovery with in silico analysis of bio-informatic databases

Abstract

Tachykinins are signalling peptides released by the processing of preprotachykinin precursors, which are subject to post-translational modifications including amidation. Tachykinins act on the three tachykinin receptors NK1, NK2 and NK3. Differential processing of the preprotachykinin precursors can lead to the formation of a diverse range of tachykinins (including extended forms). Our previous findings have shown increased proteolytic cleavage of the human TAC3 and TAC4 preprotachykinin precursors by the placenta in pathological conditions such as pre-eclampsia comparable to that found in the brain. This study has developed an experimental strategy for the capture and detection of tachykinins combining peptide extraction, enrichment by immunoaffinity purification, RP-HPLC separation and MALDI-TOF. The combined application of these methods in rat brain identified mHK-1 as an amidated decapeptide and also captured and detected SP. The detection of a modified form of mHK-1 in the brain matching the mass of an additional acetyl group (+42 a.m.u.) indicates the existence of a neuropeptide–specific post-translational modification. The biological role of acetylation is to provide greater stability for the peptide and affinity of binding for its receptor. The methodology described in this research could be applied for the capture of tachykinins expressed in normal, pre-eclamptic and IUGR placentae, in order to investigate the changes that occur in precursor processing during disease states such as pre-eclampsia and to identify post-translational modifications. A parallel in silico analysis of the publicly accessible NCBI and Ensembl databases was conducted to identify tachykinin precursors. Multiple sequence alignment of retrieved preprotachykinin sequences was conducted and the phylogenetic relationship between the identified species investigated. Collectively, the results expand the number of known or predicted tachykinins and tachykinin gene-related peptides. Moreover, they separate the preprotachykinin precursors into three distinct groups. The analysis also sheds light on the evolution of the tachykinin precursor cleavage sites (e.g. the N-terminal monobasic cleavage site of human EKA/B). Overall, this study has developed technologies for identifying tachykinin precursor post-translation modifications that may serve as a tool for determining different peptide physiologies between neuronal and peripheral tissues and different disease states.

Οι ταχυκινίνες είναι πεπτίδια σηματοδότησης που απελευθερώνονται από την επεξεργασία προδρόμων ουσιών προπρωταχυκινίνης, τα οποία υπόκεινται σε μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις, συμπεριλαμβανομένης της αμίδωσης. Οι ταχυκινίνες δρουν στους τρεις υποδοχείς ταχυκινίνης NK1, NK2 και NK3. Η διαφορική επεξεργασία των προδρόμων ουσιών της προπρωταχυκινίνης μπορεί να οδηγήσει στο σχηματισμό ποικίλου φάσματος ταχυκινινών (συμπεριλαμβανομένων των εκτεταμένων μορφών). Τα προηγούμενα ευρήματά μας, έδειξαν αυξημένη πρωτεολυτική διάσπαση των προδρόμων των ανθρώπινων TAC3 και TAC4 προπρωταχυκινίνης από τον πλακούντα σε παθολογικές καταστάσεις όπως η προεκλαμψία συγκρίσιμη με αυτή που βρίσκεται στον εγκέφαλο. Αυτή η μελέτη έχει αναπτύξει μια πειραματική στρατηγική για τη σύλληψη και την ανίχνευση ταχυκινινών που συνδυάζει εκχύλιση πεπτιδίων, εμπλουτισμό με καθαρισμό ανοσοσυγγένειας, διαχωρισμό RP-HPLC και MALDI-TOF. Η συνδυασμένη εφαρμογή αυτών των μεθόδων σε εγκέφαλο αρουραίου αναγνώρισε το mHK-1 ως αμιδωμένο δεκαπεπτίδιο και επίσης συνέλαβε και ανίχνευσε το Substance P. Η ανίχνευση μιας τροποποιημένης μορφής mHK-1 στον εγκέφαλο που ταιριάζει με τη μάζα μιας επιπρόσθετης ακετυλομάδας (+42 π.μ. u.) υποδεικνύει την ύπαρξη ειδικής για το νευροπεπτίδιο μετα-μεταφραστική τροποποίηση. Ο ρόλος της ακετυλίωσης είναι να παρέχει μεγαλύτερη σταθερότητα για το πεπτίδιο και συγγένεια δέσμευσης για τον υποδοχέα του. Η μεθοδολογία που περιγράφεται σε αυτή την έρευνα θα μπορούσε να εφαρμοστεί για τη δέσμευση ταχυκινινών που εκφράζονται σε φυσιολογικούς, προεκλαμπτικούς και πλακούντες IUGR, προκειμένου να διερευνηθούν οι αλλαγές που συμβαίνουν στην επεξεργασία των πρόδρομων ουσιών κατά τη διάρκεια παθήσεων όπως η προεκλαμψία και να εντοπιστούν μεταφραστικές τροποποιήσεις. Διεξήχθη μια παράλληλη in silico ανάλυση των δημοσίως προσβάσιμων βάσεων δεδομένων NCBI και Ensembl για τον εντοπισμό πρόδρομων ουσιών ταχυκινίνης. Επίσης διερευνήθηκε η φυλογενετική σχέση μεταξύ των ταυτοποιημένων ειδών. Συλλογικά, τα αποτελέσματα επεκτείνουν τον αριθμό των γνωστών ή προβλεπόμενων ταχυκινινών και πεπτιδίων που σχετίζονται με το γονίδιο της ταχυκινίνης. Επιπλέον, διαχωρίζουν τις πρόδρομες ενώσεις της προπρωταχυκινίνης σε τρεις διακριτές ομάδες. Η ανάλυση ρίχνει επίσης φως στην εξέλιξη των θέσεων διάσπασης του προδρόμου της ταχυκινίνης (π.χ. η Ν-τερματική μονοβασική θέση διάσπασης του ανθρώπινου ΕΚΑ/Β). Συνολικά, αυτή η μελέτη έχει αναπτύξει τεχνολογίες για τον εντοπισμό τροποποιήσεων προδρόμου ταχυκινίνης μετά τη μετάφραση που μπορεί να χρησιμεύσει ως εργαλείο για τον προσδιορισμό διαφορετικών πεπτιδικών φυσιολογιών μεταξύ νευρωνικών και περιφερικών ιστών και διαφορετικών καταστάσεων ασθένειας.