Η βιορρόφηση ως απορρυπαντική μέθοδος: δέσμευση μακρόβιων ραδιονουκλιδίων και βαρέων μετάλλων από μικροοργανισμούς που ενυπάρχουν σε τρόφιμα

Abstract

Rapid population growth and industrialization worldwide have resulted in severe contamination of the hydrosphere with heavy metals and radionuclides. However, microorganisms have the ability to bind these environmental contaminants and can potentially be used in microbial remediation technologies. Certain microorganisms have been classified as probiotics by international organizations, due to their beneficial effect on the health when consumed in adequate quantities. The presence of probiotic micro-organisms in foods or food supplements combines beneficial health benefits for consumers with their ability to act as potential detoxification agents. The aim of this thesis was to investigate the passive surface uptake of five metals by lyophilized/ freeze dried cells of microorganisms found in foods. Specifically, the metals studied were uranium, europium, barium, cobalt and cesium, which could potentially be ingested through food or drinking water. The probiotic microorganisms selected to be studied were Lactobacillus casei (L. casei) ATCC 393 and Saccharomyces boulardii (S. boulardii). Steptococcus thermophilus (S. thermophilus) was also selected, as it is found in foods derived from the fermentation of dairy products, such as cheese, yoghurt, etc. The microorganisms were studied for their chemical and physical surface characteristics using micro-electrophoretic measurements, potentiometric titration curves, Scanning Electron Microscopy (SEM), Energy Dispersive X-ray Spectroscopy (EDS), and Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR).Potentiometric titration curves of the S. thermophilus cell surface showed a significant amounts of carboxyl groups (>50%), and smaller amounts (in the order of 10%) of phosphonate, hydroxyl and (probably amino- and sulfhydryl-) groups, which were confirmed by FT-IR spectroscopy. Metal uptake by microorganisms was initially evaluated in an inert electrolyte (Ι=0,1 M NaClO4), as a function of time, pH, equilibrium metal concentration and ionic strength of the solution. Metal concentrations were determined as a function of time and at equilibrium and the obtained data were fitted to the most widely used relevant models. Measurements of concentrations as a function of time were fitted to the pseudo-first and pseudo-second order reaction models, Elovich equation, double exponential equation, Weber-Morris model, Boyd graphs and Bahangam equation. Equilibrium concentration measurements were presented as adsorption isotherms and fitted to the Langmuir, Freundlich, Temkin, Dubinnin-Radushkevich (D-R), and Redlich-Peterson models. The corresponding parameters for all models were calculated. The study found that the metal binding capacity of all microorganisms in the inert electrolyte increased as the pH increased from acidic to neutral. This suggests the influence of electrostatic forces. The study also compared the capacity of microorganisms in uranium, europium, barium, cobalt and cesium as a function of pH, with that of activated carbon, a material with known adsorptive properties. The comparison was made under identical experimental conditions, using either activated carbon from Merck, or a pharmaceutical product containing activated carbon as active ingredient, called 'Carbosylane'. The comparison showed that the microorganisms exhibited higher metal capacity (except for cesium), despite their small specific surface area. This is likely due to their low pHpzc/ pHiep values. In more detail, our findings are as follows. The kinetics of uranium binding at a concentration of 150 mg L-1 to S. thermophilus cells in inert electrolyte at pH=4.3 followed pseudo-second-order kinetics. The mechanism showed a co-existence of external and intra-particle diffusion. Equilibrium was established within two hours, with over 95% of the metal bound. In parallel experiments with activated carbon, only 8% of the uranium was bound, but equilibrium was established in less than 2 min. The isotherm of uranium uptake onto S. thermophilus cells in an inert electrolyte fitted both the Freundlich and Langmuir models. The estimated maximum uranium uptake (qmax) was 96 mg g-1 at pH=3.1. Analysis of the isothermal data using Scatchard plots indicated the presence of either two independent uranium receptors on the cells or one receptor with negative synergy at low and high concentrations of the metal. The amount of uranium bound was found to be independent of the ionic strength of the solution, implying the formation of an inner sphere complex. The binding of uranium was confirmed by comparing FT-IR and EDS spectra of S. thermophilus cells before and after exposure to the metal, by the appearance of a characteristic peak at 930 cm-1 and by the intensive uranium peaks in the EDS spectrum. The kinetics of europium binding to S. thermophilus cells in an inert electrolyte at pH 4.5 were rapid, completing in less than 2 minutes. The isothermal data at pH 2.6 and 3.9 fitted well only with the Langmuir model, which estimated maximum metal capacities (qmax) of 39 and 59 mg g-1 respectively. Although the experimental data fitted well with the Langmuir model, further Scatchard processing did not reveal additional information. Competitive binding experiments were performed on S. thermophilus cells in an inert electrolyte in the acidic pH range with a total concentration of 1.0 × 10-5 M for both uranium and europium. The amount of uranium bound was higher (approximately 10 to 15%), as it was confirmed by semi-quantitative EDS analysis. Barium and cobalt were bound to S. thermophilus cells in an inert electrolyte at acidic pH. The cells were isolated from either the exponential or stationary growth phase of the microorganism. The amount of metal bound did not vary significantly. Experiments were performed to determine the amount of barium and cobalt bound to S. thermophilus through inert electrolyte as a function of equilibrium metal concentration at pH≈6.0. The data were best fitted to the Freundlich isotherm model. The binding of barium is strongly dependent on the ionic strength of the solution, indicating that the phenomenon is dominated by electrostatic forces. In an inert electrolyte, S. boulardii cells and activated carbon showed a metal binding percentage of 2% and 8% respectively, when exposed to a concentration of 1.0 × 10-5 M of cesium in the pH range of 2 to 10. This indicates that cesium is the only element tested in this study, that was not bound significantly to cells of microorganisms found in food. Finally, uranium uptake on S. thermophilus cells was carried out under identical conditions, replacing the inert electrolyte (Ι=0,1 M NaClO4) by synthetic gastric fluid at pH 1.6. The substitution resulted in a slower process and a reduced amount of uranium bound. However, the same kinetic equation, diffusion mechanism and isotherm model were followed in the synthetic gastric fluid as in the inert electrolyte.

Η ταχεία αύξηση του πληθυσμού και η απότομη εκβιομηχάνιση παγκοσμίως, έχουν οδηγήσει σε σοβαρή ρύπανση της υδρόσφαιρας με βαρέα μέταλλα και ραδιονουκλείδια. Ωστόσο, είναι γνωστό ότι οι μικροοργανισμοί έχουν την ικανότητα να δεσμεύουν αυτούς τους ρύπους, και ως εκ τούτου μπορούν να βρουν εφαρμογές σε τεχνολογίες μικροβιακής αποκατάστασης. Ορισμένοι μικροοργανισμοί έχουν ταξινομηθεί ως προβιοτικοί από διεθνείς οργανισμούς, λόγω της ευεργετικής τους επίδρασης στην υγεία όταν καταναλώνονται σε επαρκείς ποσότητες. Η παρουσία προβιοτικών μικροοργανισμών σε τρόφιμα ή συμπληρώματα διατροφής, συνδυάζει τα ευεργετικά πλεονεκτήματα στη υγεία των καταναλωτών με την ικανότητα τους να δρουν ως δυνητικά μέσα αποτοξίνωσης. Στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η διερεύνηση της παθητικής επιφανειακής δέσμευσης πέντε μετάλλων από λυοφιλοποιημένα κύτταρα μικροοργανισμών που συναντώνται στα τρόφιμα. Συγκεκριμένα μελετήθηκαν τα μέταλλα: ουράνιο, ευρώπιο, βάριο, κοβάλτιο και καίσιο, τα οποία δυνητικά θα μπορούσαν να προσληφθούν μέσω της τροφής ή του πόσιμου νερού.Οι προβιοτικοί μικροοργανισμοί που επιλέχθηκαν να μελετηθούν ήταν: ο Lactobacillus casei (L. casei) ATCC 393 και ο Saccharomyces boulardii (S. boulardii). Επελέγη επίσης ο Steptococcus thermophilus (S. thermophilus), που συναντάται στα τρόφιμα που προέρχονται από τη ζύμωση γαλακτοκομικών προϊόντων, όπως τυρί, γιαούρτι κλπ.Τα χημικά και φυσικά χαρακτηριστικά της επιφάνειας των μικροοργανισμών που μελετήθηκαν, διερευνήθηκαν με μικρο-ηλεκτροφορητικές μετρήσεις, ποτενσιομετρικές καμπύλες τιτλοδότησης, Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης (SEM), Φασματοσκοπία ακτίνων-Χ Ενεργειακής Διασποράς (EDS) και Φασματοσκοπία Υπέρυθρου Μετασχηματισμού Fourier (FT-IR). Οι ποτενσιομετρικές καμπύλες τιτλοδότησης της επιφάνειας των κυττάρων του S. thermophilus έδειξαν σημαντική παρουσία καρβοξυλομάδων (ποσοστό >50%), και μικρότερα ποσοστά (της τάξης του 10%) φωσφονικών, υδροξύλ- και (πιθανώς άμινο- και σουλφυδρύλ-) ομάδων, τα οποία επιβεβαιώθηκαν μέσω φασματοσκοπίας FT-IR. Η ικανότητα δέσμευσης των μετάλλων από τους μικροοργανισμούς, αξιολογήθηκε αρχικά σε αδρανή ηλεκτρολύτη (Ι=0,1 M NaClO4), συναρτήσει του χρόνου, του pH, της συγκέντρωσης του μετάλλου σε κατάσταση ισορροπίας και της ιοντικής ισχύος του διαλύματος. Προσδιορίστηκαν συγκεντρώσεις των μετάλλων συναρτήσει του χρόνου και σε κατάσταση ισορροπία και τα δεδομένα προσαρμόσθηκαν στα ευρύτερα χρησιμοποιούμενα αντίστοιχα μοντέλα. Για την κινητική του φαινομένου χρησιμοποιήθηκαν τα μοντέλα της ψευδο-πρώτης και ψευδο-δευτέρας τάξης αντίδρασης, εξίσωση Elovich, εξίσωση διπλής εκθετικής, μοντέλο Weber-Morris, γραφήματα Boyd και εξίσωση Bahangam. Οι μετρήσεις των συγκεντρώσεων ισορροπίας, παρουσιάστηκαν υπό μορφή ισοθέρμων προσρόφησης, προσαρμόσθηκαν στα μοντέλα Langmuir, Freundlich, Temkin, Dubinnin-Radushkevich (D-R) και Redlich-Peterson και υπολογίσθηκαν οι αντίστοιχες παράμετροι όλων των μοντέλων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ικανότητα δέσμευσης των μετάλλων από όλους τους υπό μελέτη μικροοργανισμούς σε αδρανή ηλεκτρολύτη, αυξήθηκε αυξανομένου του pH στην όξινη έως την ουδέτερη περιοχή pH, υποδεικνύοντας την επίδραση ηλεκτροστατικής φύσεως δυνάμεων. Επιπροσθέτως, η χωρητικότητα των μικροοργανισμών σε ουράνιο, ευρώπιο, βάριο, κοβάλτιο και καίσιο συναρτήσει του pH, συγκρίθηκε με αυτή του ενεργού άνθρακα, ενός υλικού με γνωστές προσροφητικές ιδιότητες. Η σύγκριση πραγματοποιήθηκε υπό ταυτόσημες πειραματικές συνθήκες χρησιμοποιώντας, είτε ενεργό άνθρακα της εταιρείας Merck, είτε ένα φαρμακευτικό σκεύασμα με δραστικό συστατικό τον ενεργό άνθρακα, με την ονομασία «Carbosylane». Η σύγκριση έδειξε ότι όλοι οι υπό μελέτη μικροοργανισμοί, παρά την μικρή ειδική τους επιφάνεια, παρουσίασαν μεγαλύτερη χωρητικότητα μετάλλου (εκτός του καισίου). Σε αυτό συμβάλουν πιθανά οι μικρές τιμές pHpzc/ pHiep που χαρακτηρίζουν τις επιφάνειες των μικροοργανισμών. Αναλυτικότερα, τα αποτελέσματα μας, συνοψίζονται ως εξής.Η κινητική της δέσμευσης του ουρανίου με συγκέντρωση 150 mg L-1 στα κύτταρα του S. thermophilus σε αδρανή ηλεκτρολύτη σε pH=4,3 έδειξε να ακολουθεί κινητική ψευδο-δεύτερης τάξης, ενώ ο μηχανισμός αποκαλύπτει συνύπαρξη εξωτερικής και ενδο-σωματιδιακής διάχυσης. Η ισορροπία αποκαταστάθηκε περίπου σε δυο ώρες, με ποσοστό δεσμευόμενου μετάλλου μεγαλύτερο του 95%, ενώ σε παράλληλα πειράματα με ενεργό άνθρακα το αντίστοιχο ποσοστό ουρανίου που δεσμεύθηκε ήταν μόλις 8%, αλλά η ισορροπία αποκαταστάθηκε σε χρόνο μικρότερο των 2 min. Η ισόθερμος για τη μελέτη της δέσμευσης του ουρανίου στα κύτταρα του S. thermophilus σε αδρανή ηλεκτρολύτη προσαρμόσθηκε αρκετά καλά σε αμφότερα τα μοντέλα Freundlich και Langmuir, με εκτιμώμενη μέγιστη δεσμευόμενη ποσότητα ουρανίου (qmax) 96 mg g-1 σε pH=3,1. Η ανάλυση των δεδομένων της ισοθέρμου σύμφωνα με τα γραφήματα Scatchard, υπέδειξε την ύπαρξη, είτε δυο ανεξάρτητων υποδοχέων του ουρανίου στα κύτταρα, είτε έναν υποδοχέα με αρνητική συνέργεια σε μικρές και μεγάλες συγκεντρώσεις του μετάλλου. Η μη εξάρτηση της δεσμευόμενης ποσότητας ουρανίου από την ιοντική ισχύ του διαλύματος, υπαινίσσεται σχηματισμό συμπλόκου εσωτερικής σφαίρας. Η δέσμευση του ουρανίου επιβεβαιώθηκε συγκρίνοντας φάσματα FT-IR και EDS κυττάρων του S. thermophilus πριν και μετά την επίδραση του μετάλλου, από την παρουσία χαρακτηριστικής κορυφής στα 930 cm-1, καθώς και από τις έντονες κορυφές ουρανίου στο φάσμα EDS. Η δέσμευση του ευρωπίου στα κύτταρα του S. thermophilus σε αδρανή ηλεκτρολύτη σε pH=4,5 έδειξε ταχύτατη κινητική, που ολοκληρώθηκε σε χρόνο μικρότερο των 2 min, ενώ τα δεδομένα των ισοθέρμων σε pH 2,6 και 3,9 προσαρμόσθηκαν πολύ καλά μόνο στο μοντέλο Langmuir εκτιμώντας τιμές μέγιστης δεσμευόμενης ποσότητας (qmax) 39 και 59 mg g-1 αντίστοιχα. Παρά την καλή προσαρμογή των πειραματικών δεδομένων στο μοντέλο Langmuir, η περαιτέρω επεξεργασία τους κατά Scatchard δεν παρείχε πρόσθετες πληροφορίες. Η ανταγωνιστική δέσμευση ουρανίου και ευρωπίου με ολική συγκέντρωση κάθε μετάλλου 1,0 × 10-5 Μ στα κύτταρα του S. thermophilus σε αδρανή ηλεκτρολύτη στην όξινη περιοχή pH, έδειξε μεγαλύτερη δεσμευόμενη ποσότητα ουρανίου, (περίπου 10 έως 15%) που επιβεβαιώθηκε από τις ημι-ποσοτικές αναλύσεις με EDS. Η δέσμευση βαρίου και κοβαλτίου που πραγματοποιήθηκε σε αδρανή ηλεκτρολύτη στην όξινη περιοχή pH, από κύτταρα του S. thermophilus απομονωμένα από τη στατική ή την εκθετική φάση ανάπτυξης του μικροοργανισμού, έδειξε ότι δεν υπάρχει σημαντική διαφοροποίηση της δεσμευόμενης ποσότητας του μετάλλου από τη φάση ανάπτυξης από την οποία απομονώθηκε ο μικροοργανισμός. Τα πειραματικά δεδομένα της δεσμευόμενης ποσότητας βαρίου και κοβαλτίου στον S. thermophilus από αδρανή ηλεκτρολύτη συναρτήσει της συγκέντρωσης ισορροπίας του μετάλλου σε pH≈6,0 προσαρμόσθηκαν καλύτερα στο μοντέλο ισοθέρμου Freundlich. Η ισχυρή εξάρτηση της δέσμευσης του βαρίου από την ιοντική ισχύ του διαλύματος αποκάλυψε ότι τα φαινόμενο κυριαρχείται από ηλεκτροστατικής φύσεως δυνάμεις. Σε αδρανή ηλεκτρολύτη, η δέσμευση καισίου συγκέντρωσης 1,0 × 10-5 M από κύτταρα του S. boulardii και ενεργό άνθρακα σε περιοχή pH από 2 έως 10, έδειξε ποσοστό δέσμευσης μετάλλου 2 και 8 % αντίστοιχα, αναδεικνύοντας το καίσιο ως το μόνο στοιχείο από όσα εξετάσθηκαν, το οποίο δεν δεσμεύεται σημαντικά από μικροοργανισμούς τροφίμων. Τέλος, η δέσμευση του ουρανίου στα κύτταρα του S. thermophilus πραγματοποιήθηκε κάτω από ταυτόσημες συνθήκες, αντικαθιστώντας τον αδρανή ηλεκτρολύτη (Ι=0,1 M NaClO4) με συνθετικό γαστρικό υγρό με pH 1,6. Η αντικατάσταση προκάλεσε επιβράδυνση της διεργασίας και ελάττωση της δεσμευόμενης ποσότητας ουρανίου. Εν τούτοις, στο συνθετικό γαστρικό υγρό ακολουθήθηκε η ίδια κινητική εξίσωση, ο ίδιος μηχανισμός διάχυσης και το ίδιο μοντέλου ισοθέρμου, όπως και στον αδρανή ηλεκτρολύτη.