Biochemical and molecular approaches to increase the productivity of bacteria towards desulphurization of petroleum products

Abstract

The central focus of the Thesis revolves around advancing more effective biocatalysts for biodesulfurization, aiming to address prevailing challenges within the realms of chemical hydrodesulfurization and biodesulfurization. This study pursued two primary objectives: firstly, the exploration for novel microorganisms exhibiting superior biodesulfurization capabilities and, secondly, the augmentation of biodesulfurization activity via genetic engineering, leveraging a model Pseudomonas putida strain. In pursuit of the first objective, efforts were directed toward identifying and assessing new microbial strains with enhanced proficiency in degrading sulphurous organic compounds found in crude oil. Sampling activities were concentrated in the sulfur-rich oil-escapes of the Keri marsh in South Zakynthos. Subsequently, sediment sampling was conducted in these high sulfur concentration areas, and the undisturbed soil was inoculated into specialized nutrient salts enriched with hydrocarbon mixtures containing thiophene, dibenzothiophene, and their alkylated derivatives as exclusive sulfur sources in the culture medium. Bacteria isolated from these enrichment cultures underwent molecular characterization by detecting genes associated with the 4S metabolic degradation pathway, facilitated by specially designed PCR primer molecules. Simultaneously, a comparative assessment of sulfur compound degradation rates was conducted within a small-scale multi-culture system. Strains exhibiting superior performance underwent comprehensive physiological studies pertaining to the degradation of thiophene and its derivatives. These studies included optimizing aqueous phase composition, pH levels, operating temperatures, aqueous-to-organic phase ratios, and stability within biphasic BDS (biodesulfurization) systems. Regarding the second objective, a strategy was devised by integrating a series of genetic modifications in Pseudomonas putida KT2440, encompassing one or a combination of the following approaches: (a) expression of dsz genes under the regulation of robust promoters independent of sulfur levels in the culture; (b) cloning of multiple versions of selected dsz genes; (c) elimination of gene overlaps within the dsz operon; (d) differential amplification of specific pathway enzymes' expression, such as those catalyzing substrate intermediates potentially inhibiting other enzymes or those governing the slower stages of the overall reaction.

Η βάση της παρούσας έρευνας, που παρουσιάζεται σε αυτή τη διατριβή, είναι η ανάπτυξη πιο αποτελεσματικών βιοκαταλυτών, εξειδικευμένων ως προς την βιοαποθείωση, οι οποίοι ξεπερνούν μερικά από τα προβλήματα που σχετίζονται με την τρέχουσα τεχνολογική στάθμη στο επιστημονικό πεδίο της υδρογονοαποθείωσης και βιοαποθείωσης. Χρησιμοποιήθηκαν δύο προσεγγίσεις που αντιπροσωπεύουν τους στόχους της διατριβής, (α), την αναζήτηση νέων μικροοργανισμών με καλύτερο βιοαποθειωτικό φαινότυπο και (β), την ενίσχυση της βιοαποθειωτικής ικανότητας μέσω γενετικής μηχανικής χρησιμοποιώντας το στέλεχος πρότυπο Pseudomonas putida. Στον πρώτο στόχο, αναζητήθηκαν και αξιολογήθηκαν νέα μικροβιακά στελέχη με βελτιωμένες ιδιότητες όσον αφορά την ικανότητά τους να αποικοδομούν τις θειούχες οργανικές ενώσεις που περιέχονται στο αργό πετρέλαιο. Η αναζήτηση επικεντρώθηκε σε επιλεγμένα σημεία στο έλος του Κεριού στη Νότια Ζάκυνθο. Στις περιοχές με τις υψηλότερες συγκεντρώσεις θείου, πραγματοποιήθηκε δειγματοληψία ιζημάτων. Το εν λόγω εδαφικό ίζημα εμπλουτίστηκε με ειδικά θρεπτικά άλατα που περιείχαν μίγματα θειούχων ενώσεων, ως μοναδικές πηγές θείου, όπως θειοφαίνιο, διβενζοθειοφαίνιο και τα αλκυλιωμένα παράγωγά του διβενζοθειοφαινίου. Τα βακτήρια που απομονώθηκαν από τις καλλιέργειες εμπλουτισμού χαρακτηρίστηκαν μοριακά με την ανίχνευση των γονιδίων της μεταβολικής οδού αποικοδόμησης 4S χρησιμοποιώντας ειδικά σχεδιασμένους εκκινητές για τις αντιδράσεις PCR. Παράλληλα, πραγματοποιήθηκε ταυτόχρονα μια συγκριτική μελέτη του ρυθμού αποικοδόμησης ενώσεων θείου σε ένα μικρής-κλίμακας σύστημα πολλαπλών καλλιεργειών. Για τα στελέχη με την καλύτερη απόδοση, πραγματοποιήθηκε μια πλήρης μελέτη της φυσιολογίας τους σε σχέση με την αποικοδόμηση του διβενζοθειοφαινίου και των παραγώγων του, η οποία περιλάμβανε τη βελτιστοποίηση της σύνθεσης του μέσου καλλιέργειας, του pH, της θερμοκρασίας, της αναλογίας υδατικής/οργανικής φάσης και της σταθερότητάς τους σε διφασικά συστήματα βιοαποθείωσης. Για το δεύτερο στόχο, λαμβάνοντας υπόψη τις γονιδιακές πληροφορίες και τη φυσιολογία κάθε στελέχους, αποφασίστηκε να πραγματοποιηθεί μια σειρά γενετικών τροποποιήσεων στο πρότυπο στέλεχος Pseudomonas putida KT2440 που περιλάμβαναν μία ή έναν συνδυασμό των ακόλουθων προσεγγίσεων: (α) έκφραση γονιδίων dsz υπό τον έλεγχο ισχυρών αλληλουχιών δέσμευσης ριβοσωμάτων (RBS’s) που δεν ελέγχονται από τα επίπεδα θείου στην καλλιέργεια; (β) αλλαγές της σειράς των dsz γονιδίων στο οπερόνιο (γ) αφαίρεση των γνωστών αλληλοεπικαλύψεων των γονιδίων dsz στο οπερόνιο; (δ) διαφορική ενίσχυση της έκφρασης συγκεκριμένων ενζύμων της οδού (π.χ., του ενζύμου που έχει ένα ενδιάμεσο υπόστρωμα που πιθανόν να αναστέλλει τα άλλα ένζυμα ή του ενζύμου που καταλύει το αργό στάδιο της συνολικής αντίδρασης).