Μελέτη δικτύων πρωτεόστασης που εμπλέκονται στην καρκινογενεση ή/και τη γήρανση

Abstract

Organisms are continuously exposed to a plethora of stress-inducing factors and therefore it is essential to ensure the integrity of both their genome and proteome. In particular, in order to maintain the functionality of their proteome, cells have developed the proteostasis network (PN). Key elements of this network include, among others, the two main degradation machineries, namely the Ubiquitin-Proteasome system (UPS) and Autophagy-Lysosome system (ALS), the oxidative stress-related pathway of antioxidant responses that is regulated by NRF2 (Nuclear factor -erythroid derived 2-like 2, NFE2L2)/ KEAP1(Kelch-like ECH-associated protein 1) and the molecular chaperones network. Nevertheless, recent studies by us and others indicate that during ageing both the protein machines and the cellular stress response pathways become dysfunctional as they are deregulated by accumulating damage; these catastrophic events correlate with organismal ageing, cellular senescence and most (if not all) age-related diseases, including cancer. Given that proteostasis imbalance likely represents a hallmark of carcinogenesis, the aim of this study was to analyze the functional role of key (or newly discovered) regulators of the PN and antioxidant response pathways during carcinogenesis and highlight novel anti-cancer approaches and biomarkers with the potential to develop innovative anti-cancer therapies. The first part of this work focuses on the study of the role of endogenously produced Hydrogen Sulfide in the PN, which, as mentioned above, is disturbed during carcinogenesis. For this purpose, mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were isolated from cystathionine γ-lyase (CSE) KO or mercaptopyrostaphylate sulfotransferase (3-MST) KO mice. Our results showed that dysfunction of Hydrogen Sulfide biosynthesis leads to disruption of the PN, as we found a decrease in proteolytic pathway activity and antioxidant responses. The induced disruption of the PN (a milestone of carcinogenesis) indicates the possible involvement of the Hydrogen Sulfide biosynthesis network in carcinogenesis. The second part of this thesis aimed to investigate the differential response of the proteostasis network between cancer and normal cells during short-term starvation and chemotherapy in breast cancer. Currently, a range of anti-cancer treatments exists; however, they often produce diverse side effects because they indiscriminately affect both normal and cancer cells, lacking sufficient targeting specificity. Short-term starvation has been found to have a positive impact on cancer-free survival. It also appears to sensitize cancer cells to chemotherapeutic agents and reduce chemotherapy-related adverse effects. Our results showed that the combination of fasting and chemotherapy treatment increased the endogenous levels of Reactive Oxygen Species (ROS) and decreased the antioxidant response inducing genomic damage in cancer cells. Notably, this combination did not significantly affect normal cells. Also, our data (along with data from our collaborators in this project) suggests that this effect is mediated, at least in part, through metabolic rewiring and enhanced mitochondrial dysfunctionality in cancer cells. During the third part of this PhD thesis, we analyzed the expression of PN related genes and miRNAs in both bladder cancer biopsies from patients and in cancer cell lines. Urological carcinoma is one of the most common cancer types worldwide and is considered a disease with high heterogeneity, not only at the molecular level due to the accumulation of a multitude of genetic mutations and epigenetic modifications occurring during disease progression, but also due to variations in prognosis and treatment outcome. Our data showed a significant downregulation of the HSPB2 and HSPB3 genes expression in bladder tumors as compared to matched normal urothelium; yet increased HSPB2 and HSPB3 levels were noted in muscle-invasive (T2–T4) vs. superficial tumors (TaT1), as well as in high-grade vs. low-grade tumors. Survival analyses indicated the significantly higher risk for post-treatment disease relapse in TaT1 patients poorly expressing HSPB2 and HSPB3 genes; this effect tended to be inverted in advanced disease stages (muscle-invasive tumors) where low expression of the HSPB2 and HSPB3 genes delayed disease evolvement. These findings indicate the biphasic impact of HSPB2 and HSPB3 genes in bladder cancer progression. The pro-survival role of HSPB2 and HSPB3 in advanced tumor cells was also evident by our finding that HSPB2, HSPB3 genes expression silencing in high-grade bladder cancer cells enhanced doxorubicin toxicity. This study also analyzed the biphasic impact of mir-101 in bladder cancer patients' biopsies. Specifically, we analyzed the mechanism of action of miR-101 and its association with proteasome function, using models of multistage carcinogenesis induced either genetically or chemically, along with cancer cell lines expressing or lacking tumor suppressor genes or oncogenes. Our results suggest that oncogenes may trigger mir-101 activation while its expression can be repressed by the tumor suppressor genes p53/p21. Furthermore, we found that mir-101 overexpression increased the chemosensitivity of cancer cells to chemotherapeutic agents and it reduced their migratory potential. In summary, this study focused on a thorough investigation of the PN role in carcinogenesis. Initially, we found that the PN undergoes significant alterations following Hydrogen Sulfide biosynthesis dysfunction. Additionally, we investigated the differential response of normal vs. cancer cells when exposed to a combination of chemotherapy and fasting. Our data indicate that although PN activation provides protective effects in the early stages of carcinogenesis, in advanced disease stages, it likely significantly contributes to the enhancement of malignant metastatic phenotypes. Finally, an important finding of this PhD thesis is the differential expression of mir-101 during carcinogenesis and its possible mechanism of action.

Οι οργανισμοί εκτίθενται συνεχώς σε στρεσογόνους παράγοντες και, ως εκ τούτου, είναι απαραίτητη η διασφάλιση της ακεραιότητας (μεταξύ άλλων) τόσο του γονιδιώματος όσο και του πρωτεώματος. Ειδικότερα, προκειμένου να διατηρηθεί η λειτουργικότητα του πρωτεώματος, τα κύτταρα έχουν αναπτύξει το δίκτυο πρωτεόστασης. Βασικά στοιχεία του δικτύου αυτού, μεταξύ άλλων, είναι τα πρωτεολυτικά μονοπάτια του κυττάρου ουβικιτίνης-πρωτεασώματος (Ubiquitin-Proteasome system, UPS) και αυτοφαγίας-λυσοσώματος (Autophagy-Lysosome system, ALS), το σηματοδοτικό μονοπάτι αντιοξειδωτικής απόκρισης NRF2 (Nuclear factor -erythroid derived 2-like 2, NFE2L2)/ KEAP1(Kelch-like ECH-associated protein 1) καθώς και το δίκτυο μοριακών συνοδών. Παρόλα αυτά, με την πάροδο του χρόνου οι πρωτεϊνικές μηχανές και τα συστήματα ελέγχου του κυττάρου αρχίζουν να απορρυθμίζονται και να δυσλειτουργούν εξαιτίας της συσσώρευσης βλαβών, οδηγώντας έτσι στην εμφάνιση του γήρατος και διαφόρων ηλικιο-εξαρτώμενων ασθενειών όπως είναι ο καρκίνος, ο διαβήτης, οι καρδιαγγειακές διαταραχές και οι νευροεκφυλιστικές παθήσεις. Δεδομένου ότι, όπως έχουν δείξει μελέτες του εργαστηρίου μας και άλλων, η πρωτεωμική αστάθεια θεωρείται σημαντικό ορόσημο της γήρανσης και της καρκινογένεσης, σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η ανάλυση του λειτουργικού ρόλου βασικών ρυθμιστών του δικτύου πρωτεόστασης και μονοπατιών αντιοξειδωτικής απόκρισης κατά την καρκινογένεση με στόχο την ανάδειξη νέων καινοτόμων αντικαρκινικών προσεγγίσεων και βιοδεικτών με πιθανή διαγνωστική και προγνωστική αξία κατά την έναρξη και την εξέλιξη της νόσου. Αρχικά στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής διερευνήθηκε ο ρόλος του ενδογενώς παραγόμενου υδρόθειου στο δίκτυο πρωτεόστασης η λειτουργία του οποίου, όπως αναφέρθηκε, διαταράσσεται κατά τη καρκινογένεση. Για το σκοπό αυτό απομονώθηκαν εμβρυικοί ινοβλάστες από ποντίκια στα οποία έχουν απαλειφθεί τα ένζυμα βιοσύνθεσης του υδρόθειου, γ-λυάση της κυσταθειονίνης (CSE) ή σουλφοτρανσφεράση του μερκαπτοπυροσταφυλικού (3-MST), με στόχο τη μελέτη της επίδρασης των δύο ενζύμων στο δίκτυο πρωτεόστασης. Οι παρατηρήσεις μας αποκάλυψαν ότι η δυσλειτουργεία βιοσύνθεσης του υδρόθειου οδηγεί σε διατάραξη του πρωτεοστατικού δικτύου καθώς διαπιστώθηκε μείωση της ενεργότητας των πρωτεολυτικών μονοπατιών και της αντιοξειδωτικής απόκρισης. Η προκαλούμενη διαταραχή του πρωτεοστατικού δικτύου (ορόσημο καρκινογένεσης) υποδεικνύει την πιθανή εμπλοκή του δικτύου βιοσύνθεσης του υδρόθειου στην καρκινογένεση η οποία δύναται να μελετηθεί περαιτέρω. Στο δεύτερο τμήμα της παρούσας διδακτορική διατριβή διερευνήθηκε η διαφορική απόκριση του δικτύου πρωτεόστασης μεταξύ καρκινικών και φυσιολογικών κυττάρων σε συνθήκες μειωμένης πρόσληψης θρεπτικών που προηγούνται της χημειοθεραπείας σε καρκινικές κυτταρικές σειρές μαστού. Σήμερα είναι διαθέσιμες διαφόρων ειδών θεραπείες έναντι των καρκινικών κυττάρων, οι οποίες όμως επιφέρουν αρκετών ειδών παρενέργειες, που οφείλονται στο γεγονός ότι δρουν και σε φυσιολογικά κύτταρα και δεν είναι αρκετά στοχευμένες. Η μειωμένη πρόσληψη αναπτυξιακών παραγόντων (θερμιδική στέρηση) έχει βρεθεί να έχει θετικό αντίκτυπο στη μη εμφάνιση καρκίνου. Επίσης φαίνεται να ευαισθητοποιεί τα καρκινικά κύτταρα σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες και να μειώνει τις ανεπιθύμητες ενέργειες που σχετίζονται με τη χημειοθεραπεία. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο συνδυασμός «νηστείας» και χημειοθεραπείας αύξησε τα ενδογενή επίπεδα ενεργών μορφών οξυγόνου (Reactive Oxygen Species, ROS) και μείωσε την αντιοξειδωτική απόκριση σε συνδυασμό με αύξηση της γενωμικής βλάβης στα καρκινικά κύτταρα ενώ αντίθετα δεν προκάλεσε σημαντικές μεταβολές στα φυσιολογικά κύτταρα. Ακόμη βρέθηκε ότι η αύξηση των ROS συνοδευόταν από μειωμένη μιτοχονδριακή λειτουργία και αλλαγές στο μεταβολικό προφίλ ειδικά στα καρκινικά κύτταρα. Τέλος, μελετήθηκε η έκφραση γονιδίων του δικτύου πρωτεόστασης καθώς και miRNAs που εμπλέκονται στο πρωτεοστατικό δίκτυο σε βιοψίες ασθενών με καρκίνο της ουροδόχου κύστεως και σε καρκινικές κυτταρικές σειρές. Το ουρολογικό καρκίνωμα είναι ένας από τους πιο συχνούς τύπους καρκίνου παγκοσμίως και θεωρείται μία ασθένεια με μεγάλη ετερογένεια, όχι μόνο σε μοριακό επίπεδο εξαιτίας της συσσώρευσης πληθώρας γενετικών μεταλλαγών και επιγενετικών τροποποιήσεων που συμβαίνουν κατά την εξέλιξη της νόσου, αλλά και όσο αναφορά στην πρόγνωση και το αποτέλεσμα της θεραπείας. Όσον αναφορά στο πρώτο κομμάτι μελετήθηκε η διαφορική έκφραση των γονιδίων των μοριακών συνοδών μικρού μοριακού βάρους HSPB2 και HSPB3 ανάμεσα σε καρκινικό και παρακείμενο φυσιολογικό ιστό. Αρχικά παρατηρήθηκε αυξορρύθμιση σε μυοδιηθητικούς όγκους (T2–T4) έναντι επιφανειακών όγκων (TaT1), καθώς και σε όγκους υψηλού βαθμού κακοήθειας έναντι χαμηλού βαθμού κακοήθειας. Οι αναλύσεις σχετικά με την πορεία της ασθένειας έδειξαν το σημαντικά υψηλότερο κίνδυνο για υποτροπή της νόσου μετά τη θεραπεία σε ασθενείς TaT1 που εκφράζουν μειωμένα επίπεδα HSPB2 και HSPB3. Το αποτέλεσμα αυτό αντιστρέφεται σε προχωρημένα στάδια της νόσου (μυοδιηθητοί όγκοι) υποδεικνύοντας τη διφασική επίδραση των γονιδίων HSPB2 και HSPB3 στην εξέλιξη της νόσου. Ο ρόλος των γονιδίων HSPB2 και HSPB3 στην επιβίωση ειδικά των καρκινικών κυττάρων προχωρημένου σταδίου φάνηκε και από πειράματα αποσιώπησή τους (siRNA) σε κύτταρα προχωρημένου σταδίου που οδήγησε σε αύξηση της χημειοευαισθησίας και μείωση της βιωσιμότητας των καρκινικών κυττάρων. Παρόμοια ήταν τα αποτελέσματα και από την μελέτη της έκφρασης ενός micro-RNA και ειδικότερα του mir-101 σε βιοψίες από ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστεως όπου φάνηκε η διφασική έκφραση αλλά και επίδραση του στην καρκινογένεση. Χρησιμοποιώντας μοντέλα πολυσταδιακής καρκινογένεσης η οποία έχει προκληθεί είτε με γενετικό είτε με χημικό τρόπο αλλά και καρκινικές σειρές με αποσιωπημένα ογκοκατασταλτικά γονίδια επιχειρήθηκε η ανάλυση του μηχανισμού δράσης του mir-101 και η σύνδεσή του με τη λειτουργία του πρωτεασώματος. Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι πιθανότατα η δράση των ογκογονιδίων ενεργοποιεί το mir-101, του οποίου η έκφραση καταστέλλεται από τα ογκοκατασταλτικά γονίδια p53/p21. Ακόμη, φάνηκε ότι η υπερέκφραση του mir-101 αυξάνει σημαντικά την χημειοευαισθησία των καρκινικών κυττάρων σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες μειώνοντας παράλληλα το μεταναστευτικό τους δυναμικό. Συνοψίζοντας, η παρούσα διδακτορική διατριβή επικεντρώθηκε στην περαιτέρω διερεύνηση του ρόλου του δικτύου πρωτεόστασης στην καρκινογένεση. Αρχικά διαπιστώθηκε ότι το δίκτυο πρωτεόστασης διαταράσσεται από την ανεπάρκεια βιοσύνθεσης του αέριου διαβιβαστή υδρόθειου όπως και ότι συμβάλλει στη διαφορική ευαισθησία φυσιολογικών έναντι καρκινικών κυττάρων σε συνθήκες συνδυαστικής χημειοθεραπείας με μειωμένη παροχή αναπτυξιακών παραγόντων («νηστεία»). Επίσης φάνηκε ότι αν και η ενεργοποίηση των πρωτεοστατικών δικτύων (proteostatic modules) προσφέρει προστατευτικό ρόλο έναντι της νόσου κατά τα αρχικά στάδια της καρκινογένεσης, σε προχωρημένα στάδια της νόσου πιθανόν συμβάλλει σημαντικά στην ενίσχυση των κακοηθών μεταστατικών φαινοτύπων. Τέλος σημαντικό εύρημα της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτελεί η διαφορική έκφραση του mir-101 κατά τη καρκινογένεση και ο πιθανός μηχανισμός δράσης του.