Εφαρμογή υπολογιστικών μεθόδων στην στόχευση πρωτεϊνών για την καταστολή διεργασιών αναγνώρισης και μεταβολισμού φυσιολογικού και καρκινικού κυττάρου

Abstract

Cancer characterizes a group of diseases where uncontrolled cell proliferation is denoted as a common feature. Unlike normal cells, which grow, divide, and die in a tightly controlled manner, cancer cells alter normal processes of the cell cycle. Many answers to the treatment of diseases can be given by targeted protein inhibition in important cellular pathways, since proteins constitute the most versatile macromolecules involved in all biological pathways in cells. A principal question in basic cancer research and cancer therapy lies in decoding the differences between normal and cancer cells for the effective design and development of drugs with selective action. One of the most fundamental changes between cancer and normal cells is the alteration of the metabolic pathway. In normal cells, metabolism includes aerobic glycolysis, and oxidative phosphorylation, through which energy gain is attributed to the cell with the production of adenosine triphosphate (ATP). In contrast, cancer cells are characterized by increased aerobic glycolysis and use predominantly this metabolic pathway to produce ATP as the main source of energy, a phenomenon also known as the Warburg effect. Consequently, cancer cells exhibit reduced oxidative phosphorylation and increased production of building blocks required for cell growth and proliferation. The strategic study of the glycolytic pathway of cancer cell metabolism involves the study of important protein molecules, whilst the contribution of protein homeostasis may elucidate the molecular mechanisms underlying carcinogenesis. In recent years, a lot of emphasis has been given to monocarboxylate transporter 4 (MCT4), a protein widely distributed in glycolytic tissues. Many studies confirm the role of MCT4 as a transporter of L-lactate in cancer cells with a glycolytic phenotype, and the inhibition of MCT4 is predicted to induce of lactic acidosis, disruption of glycolysis, and death of the cancer cell. To date and to the best of our knowledge, while literature and experimental studies show that MCT4 inhibition has an anticancer effect, there is no known inhibitor that acts selectively against MCT4 and blocks the efflux of lactate from the cancer cell. Aiming towards the structural characterization of MCT4 for anticancer drug design, in this thesis we employed a rational pipeline for anticancer therapeutic strategies, comprised of molecular modeling approaches, molecular dynamics simulations, and the creation of a three-dimensional pharmacophoric model as a novel approach for the discovery of specific MCT4-inhibitors.MCT4 is a transmembrane transporter composed of 12 transmembrane helices with a distinguished symmetry between the N-terminal and C-terminal domains, TM1-6 and TM7-12 respectively, linked through a flexible cytoplasmic loop. This characteristic structure forms a core transport channel and assigned flexibility to the transporter, supporting the 'rocker switch' mechanism. Through this mechanism, the transporter acquires different conformations (inward open and outward open conformation) alternating the substrate access through the membrane. To date, there is no crystal structure for MCT4, and due to the limitations of membrane structures in crystallography there is limited availability of homologous transporters. In order to create a representative MCT4 model, a holistic phylogenetic analysis was firstly performed to investigate the evolutionary relationship of MCT4 amongst species, as well as the evolutionary relationship amongst the SLC16 family members in mammals. The SLC16 phylogeny shows a close evolutionary relationship between MCT1-4, while the remaining members show a distant relationship, with MCT8 and MCT10 responsible for the transport of thyroid hormones and aromatic amino acids, respectively, having the most distant evolutionary relationship. Among species, MCT4 is localized in the animal and fungal kingdoms, and the N-terminal structural region of the protein (TM1-TM6) shows a higher level of conservation as it is mainly involved in proton binding and monocarboxylate transporter insertion into the membrane, while the C- terminal structural region (TM7-TM12) involved in substrate binding shows a lower percentage of conserved amino acid residues. The phylogenetic analysis led to a hybrid approach of template selection and threading was employed to model the three-dimensional structure of human MCT4 (hMCT4), based on the conserved structure of the Major Facilitator Superfamily (MFS) transporters, and selecting by structural groups of sequence similarity the appropriate templates. The final 3-D homology model was based on the crystal structure of the glucose transporter hGLUT1, which facilitates glucose translocation across the membrane with a prominent role in cancer metabolism, and the crystal structure of a bacterial MCT4 homologue, Syntrophobacter fumaroxidans MPOB (SfMOB), that exhibits the highest homology amongst the identified crystal structures. The resulting 3D model was energetically minimized and evaluated for its overall structural and energetic features and its orientation in the membrane. The model was found to retain all features known for MCT4 conformation, such as the orientation and position of transmembrane helices in the membrane and the accessibility and orientation of ‘key’ aminoacids that participate in the transport mechanism as well as the overall structural stability of MCT4. The model was then subjected to molecular dynamics protocols to simulate the transporter in the membrane and was found to maintain an overall stable energetic state between alternating conformations. A pharmacophore model was then designed as a dynamic approach based on protein structure and molecular dynamics simulations. Following an initial 'blind' search for pharmacophoric elements against the protein structure, and through a mathematical spatiotemporal analysis of physicochemical characteristics attributed to the conformations predicted by molecular dynamics simulations, the most important pharmacophore properties consistent over the course of the simulation time were chosen. The designed 3D pharmacophore model consisted of seven important features in the transport channel core, one projected aromatic ring group, five projected hydrogen bond acceptor sites, and one group representing both hydrogen bond acceptor and donor. These features are associated with important hMCT4 amino acid residues involved in substrate translocation as well as alternative conformations acquired by the transporter. Finally, to evaluate the pharmacophore model and assess its potential for predicting novel specific substrates for MCT4 inhibition, a computational comparison was performed against experimentally determined compounds with inhibitory propensity, verifying the analogies of the pharmacophoric properties of the present model with the experimental data. The holistic approach and methodology that was employed herein resulted in the design of a representative MCT4 homology model and a consequent pharmacophore model available for systematic screening for potential MCT4 inhibitors, and constitutes an innovative pathway in rational drug design and in our effort to develop novel anticancer strategies.

Ο καρκίνος χαρακτηρίζει μια ομάδα ασθενειών στις οποίες κοινό χαρακτηριστικό είναι ο ανεξέλεγκτος πολλαπλασιασμός των κυττάρων. Σε αντίθεση με τα φυσιολογικά κύτταρα, τα οποία αυξάνονται, διαιρούνται και πεθαίνουν με αυστηρά ελεγχόμενο τρόπο, τα καρκινικά κύτταρα διαφοροποιούν τις φυσιολογικές διεργασίες του κυτταρικού κύκλου. Πολλές απαντήσεις στην αντιμετώπιση των ασθενειών μπορούν να δοθούν από στοχευμένη καταστολή πρωτεϊνών που εμπλέκονται σε σημαντικά κυτταρικά μονοπάτια, εφόσον οι πρωτεΐνες είναι τα πιο πολυδύναμα μακρομόρια στους οργανισμούς κι επιτελούν όλες τις σημαντικές διεργασίες στα κύτταρα. Ένα από τα πιο σημαντικά ζητήματα στη θεραπεία του καρκίνου είναι η κατανόηση των διαφορών μεταξύ φυσιολογικών και μη φυσιολογικών κυττάρων για τον αποτελεσματικό σχεδιασμό και την ανάπτυξη φαρμάκων με επιλεκτική δράση. Η μεταβολική οδός αποτελεί μία από τις βασικότερες αλλαγές μεταξύ καρκινικών και φυσιολογικών κυττάρων. Στα μεν φυσιολογικά κύτταρα, περιλαμβάνει την αερόβια γλυκόλυση, και την οξειδωτική φωσφορυλίωση, μέσω των οποίων αποδίδεται στο κύτταρο ενεργειακό κέρδος με την παραγωγή τριφωσφορικής αδενοσίνης (ΑΤΡ). Αντίθετα, τα καρκινικά κύτταρα χαρακτηρίζονται από αυξημένη αερόβια γλυκόλυση και χρησιμοποιούν κυρίαρχα αυτή τη μεταβολική οδό για την παραγωγή του ATP ως κύρια πηγή ενέργειας, ένα φαινόμενο γνωστό και ως φαινόμενο Warburg (Warburg effect). Συνέπεια αυτού, τα καρκινικά κύτταρα εμφανίζουν μειωμένη οξειδωτική φωσφορυλίωση και αυξημένη παραγωγή των δομικών μονάδων που απαιτούνται για την ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό του κυττάρου. Η στρατηγική μελέτη της γλυκολυτικής οδού του μεταβολισμού των καρκινικών κυττάρων εμπλέκει τη δράση σημαντικών πρωτεϊνικών μορίων και η συνεισφορά της πρωτεϊνικής ομοιόστασης μπορεί να αποσαφηνίσει τους μοριακούς μηχανισμούς που διέπουν την καρκινογένεση. Τα τελευταία χρόνια δίνεται έμφαση στον μονοκαρβοξυλικό μεταφορέα 4 (monocarboxylate transporter 4 - MCT4), μια πρωτεΐνη με ευρεία κατανομή σε γλυκολυτικούς ιστούς. Πολλές μελέτες επιβεβαιώνουν το ρόλο του MCT4 ως μεταφορέα του γαλακτικού οξέος σε καρκινικά κύτταρα με γλυκολυτικό φαινότυπο και η παρεμπόδιση του ρόλου του MCT4 ως μεταφορέα γαλακτικού οξέος προβλέπεται να δημιουργήσει συνθήκες γαλακτικής οξέωσης, διακοπή της γλυκόλυσης και θάνατο του καρκινικού κυττάρου. Εξ όσων γνωρίζουμε μέχρι σήμερα, ενώ η βιβλιογραφία και πειραματικές μελέτες δείχνουν ότι η απορρύθμιση του βιολογικού μονοπατιού στο οποίο δρα ο MCT4 έχει θετική επίδραση στην εξέλιξη του καρκίνου, ενισχύοντας την προσέγγιση της θεραπευτική δυναμικής που μπορεί να επιτευχθεί με την αναστολή της δράσης του, δεν έχει ανακαλυφθεί αναστολέας που να δρα επιλεκτικά στον MCT4 και να παρεμποδίζει την εκροή του γαλακτικού από το καρκινικό κύτταρο. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή επιχειρείται η αποσαφήνιση των δομικών χαρακτηριστικών του MCT4 για τον αντικαρκινικό σχεδιασμό φαρμάκων, μέσω της εφαρμογής υπολογιστικών μεθόδων μοριακής μοντελοποίησης, προσομοιώσεων μοριακής δυναμικής, και δημιουργίας ενός τρισδιάστατου φαρμακοφορικού μοντέλου ως θεραπευτική προσέγγιση για την ανακάλυψη εξειδικευμένων αναστολέων έναντι του MCT4. Ο MCT4 είναι ένας διαμεμβρανικός μεταφορέας που αποτελείται από 12 διαμεμβρανικές έλικες με χαρακτηριστική συμμετρία μεταξύ των δύο δομικών περιοχών του Ν-τελικού και C-τελικού μέρους της πρωτεΐνης αποτελούμενες από 6 έλικες, ΤΜ1-6 και ΤΜ7-12 αντίστοιχα, συνδεόμενοι μέσω ενός ευέλικτου ενδοπλασματικού βρόχου. Η χαρακτηριστική αυτή δομή προσδίδει στο μεταφορέα μία ευέλικτη στερεοδιάταξη αποκτώντας διαφορετικό προσανατολισμό ως προς τη μεμβράνη, επιτρέποντας τη δημιουργία ενός καναλιού μεταφοράς υποστρώματος που μεταφέρει το γαλακτικό μέσω του μηχανισμού ‘rocker switch’, και εναλλάσσοντας την πρόσβαση του υποστρώματος διαμέσου της μεμβράνης. Για τον MCT4 δεν υπάρχει έως και σήμερα κρυσταλλογραφικά λυμένη δομή και η διαθεσιμότητα ομόλογων μεταφορέων είναι περιορισμένη λόγω των περιορισμών στις μεθόδους επίλυσης δομών διαμεμβρανικών πρωτεϊνών. Με σκοπό τη δημιουργία ενός αντιπροσωπευτικού μοντέλου του MCT4, πραγματοποιήθηκε αρχικά μία ολιστική φυλογενετική ανάλυση για τα τη διερεύνηση της εξελικτικής σχέσης του MCT4 μεταξύ των ειδών αλλά και μεταξύ των διαφορετικών μελών της οικογένειας SLC16 στα θηλαστικά. Η φυλογένεια μεταξύ των διαφορετικών μεταφορέων της οικογένειας δείχνει την στενότερη εξελικτική σχέση μεταξύ των MCT1-4, ενώ τα υπόλοιπα μέλη δείχνουν μακρινή συγγένεια, με τους MCT8 και MCT10 που είναι υπεύθυνοι για τη μεταφορά θυρεοειδικών ορμονών και αρωματικών αμινοξέων αντίστοιχα, να έχουν την πιο μακρινή εξελικτική σχέση. Μεταξύ των ειδών ο MCT4 εντοπίζεται στο βασίλειο των ζώων και μυκήτων, και η Ν-τελική δομική περιοχή της πρωτεΐνης (ΤΜ1-ΤΜ6) δείχνει υψηλότερο επίπεδο διατήρησης καθώς εμπλέκεται κυρίως στη δέσμευση πρωτονίων και στην εισαγωγή του μονοκαρβοξυλικού μεταφορέα στη μεμβράνη, ενώ η C-τελική δομική περιοχή (ΤΜ7-ΤΜ12) που συμμετέχει στη δέσμευση υποστρώματος δείχνει χαμηλότερο ποσοστό διατηρημένων αμινοξικών καταλοίπων. Μέσω της φυλογενετικής αυτής ανάλυσης, ακολουθήθηκε μία υβριδική προσέγγιση επιλογής προτύπου και ύφανσης, για την κατασκευή του μοντέλου της τρισδιάστατης δομής του MCT4 στον άνθρωπο (hMCT4), βασιζόμενοι στην συντήρηση της δομής των μεταφορέων της υπεροικογένειας κύριων διευκολυντών MFS (Major Facilitator Superfamily), και επιλέγοντας ανά δομικές ομάδες ομοιότητας αλληλουχίας τα κατάλληλα πρότυπα. Το τελικό μοντέλο βασίστηκε στην κρυσταλλογραφικά λυμένη δομή του μεταφορέα γλυκόζης hGLUT1, που διευκολύνει τη μετατόπιση της γλυκόζης κατά μήκος της μεμβράνης και έχει επίσης εξέχοντα ρόλο στον μεταβολισμό του καρκίνου, και ένα βακτηριακό ομόλογο του MCT4, το Syntrophobacter fumaroxidans MPOB (SfMOB) που επιδεικνύει την υψηλότερη ομολογία μεταξύ των κρυσταλλικών δομών που εντοπίστηκαν. Το προκύπτον τρισδιάστατο μοντέλο του hMCT4, αφού ελαχιστοποιήθηκε ενεργειακά, αξιολογήθηκε ως προς τα συνολικά δομικά και ενεργειακά του χαρακτηριστικά και τον προσανατολισμό του στη μεβράνη, και βρέθηκε να διατηρεί όλα τα χαρακτηριστικά που είναι γνωστά για τη στερεοδιαμόρφωση του MCT4, όπως προσανατολισμός και θέση διαμεμβρανικών ελίκων στην μεμβράνη και προβολή και προσανατολισμός των κύριων αμινοξικών καταλοίπων που εμπλέκονται στην δομή και τη λειτουργία μεταφοράς και κίνησης του υποδοχέα. Στη συνέχεια, το μοντέλο υποβλήθηκε σε πρωτόκολλα μοριακής δυναμικής για την προσομοίωση του μεταφορέα στη μεμβράνη και βρέθηκε να διατηρεί μια συνολικά σταθερή ενεργειακή κατάσταση μεταξύ των εναλλασσόμενων διαμορφώσεων που αποκτά. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε ο σχεδιασμός ενός φαρμακοφορικού μοντέλου ως μία δυναμική προσέγγιση που βασίζεται στη δομή της πρωτεΐνης και στις προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής. Έπειτα από μία αρχική ‘τυφλή’ αναζήτηση φαρμακοφορικών στοιχείων έναντι της δομής της πρωτεΐνης και μέσα από μία μαθηματική χωροχρονική ανάλυση φυσικοχημικών χαρακτηριστικών που αποδόθηκαν στις προβλεπόμενες από τη μοριακή δυναμική στερεοδιαμορφώσεις, εντοπίστηκαν οι πλέον σημαντικές φαρμακοφορικές ιδιότητες που διατηρούνται κατά την πάροδο του χρόνου προσομοίωσης και υπερισχύουν της δραστικότητας των υπολοίπων. Το τελικό συναινετικό τρισδιάστατο φαρμακοφορικό μοντέλο αποτελούνταν από επτά σημαντικά φαρμακοφορικά χαρακτηριστικά στον πυρήνα του καναλιού μεταφοράς, μία ομάδα προβαλλόμενου αρωματικού δακτυλίου, πέντε προβαλλόμενες θέσεις αποδέκτη δεσμού υδρογόνου και μία ομάδα που αντιπροσωπεύει τόσο αποδέκτη όσο και δότη υδρογονικού δεσμού. Τα χαρακτηριστικά αυτά συσχετίζονται με σημαντικά αμινοξικά κατάλοιπα του hMCT4 που εμπλέκονται στην μετατόπιση του υποστρώματος όσο και στις εναλλακτικές στερεοδιαμορφώσεις που αποκτά ο μεταφορέας. Τέλος, για την αξιολόγηση του φαρμακοφορικού μοντέλου και την εκτίμηση της δυναμικής του για πρόβλεψη νέων πιθανών υποστρωμάτων με δυνατότητα εξειδικευμένης αναστολής έναντι του MCT4, πραγματοποιήθηκε μία υπολογιστική σύγκριση του μοντέλου έναντι πειραματικά προσδιορισμένων ενώσεων που επιδεικνύουν ανασταλτική δράση, επαληθεύοντας την αναλογία των φαρμακοφορικών ιδιοτήτων του παρόντος μοντέλου με τα πειραματικά δεδομένα. Η ολιστική προσέγγιση και μεθοδολογία που ακολουθήθηκε για την κατασκευή του τρισδιάστατου μοντέλου της δομής του διαμεμβρανικού μεταφορέα MCT4 και ενός φαρμακοφορικού μοντέλου για τη συστηματική εφαρμογή αναζήτησης υποκαταστατών με δυνατότητα αναστολής της λειτουργίας του MCT4, αποτελεί μία καινοτόμα διαδρομή στον ορθολογικό σχεδιασμό φαρμάκων και στην προσπάθεια ανάπτυξης νέων αντικαρκινικών στρατηγικών.