Development of methodologies for the identification of biomarkers in clinical/biological samples by high resolution mass spectrometry techniques

Abstract

The major goal of 21st century toxicology is to assess the efficiency/ toxicity of drugs before the step of clinical trials, and therefore focuses on the development of quick, versatile, and cheap methods that will enable the toxicity prediction during the in-vivo testing. The novel analytical methodologies and the emerging computational resources facilitate this effort. HRMS-based metabolomics present a particular interest in the terms of modern toxicology. The metabolites have universal structures and therefore, they facilitate the animal-to-human translation. Also, the metabolome is a consistent descriptor of the phenotype, so the metabolomics studies permit the deep comprehension of the biochemistry causes of toxicity and allow the creation of prediction models as well. Under this notion the current doctoral thesis focuses on the development of thorough metabolomics methodologies in the terms of the detection of toxicity related biomarkers. The first part of this study (Chapters 4&5) presents the investigation of the nephrotoxicity caused by the administration of the antineoplastic drug Carfilzomib (Cfz). An in-vivo experiment was performed, using six mice that were treated with 8mg/kg Cfz (Cfz-group) and six mice that received normal saline (Control-group). The plasma, the kidneys and the urine were used for UPLC-HRMS-DIA-based metabolomics analysis. Multivariate and univariate chemometrics were implemented for the classification and the variable selection. In addition, library-free and library-based methods were used for metabolites identification. The study developed post-hoc analysis methods to investigate potential correlations between the metabolites and to highlight interaction between the Cfz-toxicity (phenotype) and the circulatory/ urinary system (biosample). The study showed that the Cfz has severe impact on the kidneys and disrupts the renal metabolism, inducing kidney injury. Several of the identified metabolites were related to uremic condition, oxidative stress, inflammation, and kidney impairment. The second part of this study (Chapter 6) focused on the detection of early alterations of the metabolomic profiles of oncology children’s patients, that could explain/ predict the future expression of cardiotoxicity (CT), when they would undergo chemotherapy. In collaboration with the Department of Oncology and Hematology of the Children’s Hospital “Agia Sofia”, bloods samples of patients were collected before their submission to chemotherapy. The children followed the appropriate therapeutic protocol and some expressed acute cardiotoxicity. A UPLC-HRMS-DIA metabolomics analysis was performed in the blood samples, and the a posteriori knowledge of the CT expression was used to group the children in CT-Risk and No-Risk. The investigation focused on the variable selection procedure, combining 4 complementary statistical methods (KODAMA, OPLS-DA, BORUTA, t-test). The motivating idea was that if a variable exhibits good performance in more than three of these tests, then it has increased probability to be CT-related (Bayesian Probabilistic Theory). Moreover, the study set specific criteria for the confidence of DIA-identification. Finally, the study achieved the classification of CT-risk patients with models that showed acceptable figures of merit. Moreover, identified metabolites showed early alterations in the metabolic pathways that participate in the cardiac energy metabolism and suggested that the chemotherapy triggers preexisting cardiac function abnormalities, leading to acute CT events. The last part of the study (Chapter 7) investigated the impact of the human doses of colistin (CMS) in mice, aiming to shed light on the biochemical reasons of CMS toxicity. CMS is a last resort antibiotic related with severe neuro and nephrotoxicity. Aiming to shed light on the impact of CMS in non-toxic conditions, in the current study, two doses of CMS, Low (1 mg/kg) and High (1.5 mg/kg) versus a control (normal saline), were administered to mice. Samples of plasma, kidney, and liver were analyzed with a UPLC-HRMS-DIA-based metabolomics workflow. The data were submitted to PLS-DA, PLS-R and ROC analysis. The results pointed out six dose-responding metabolites, renal dopamine dysregulation, and extended perturbations in renal purine metabolism. An intriguing finding was the increased formation of renal xanthine, which is an AChE activator, leading to rapid degradation of achetylcholine, suggesting an association of nephrotoxicity and neurotoxicity.

Σημαντικός στόχος της σύγχρονης τοξικολογίας είναι η εκτίμηση της αποτελεσματικότητας και των παρενεργειών (όπως η τοξικότητα) των φαρμακευτικών ενώσεων, πριν από το στάδιο των κλινικών δοκιμών. Για αυτό εστιάζει στην ανάπτυξη γρήγορων, πολύμορφων και φθηνών μεθόδων, που θα επιτρέπουν την πρόβλεψη της τοξικότητας κατά την διάρκεια των in-vivo δοκιμασιών. Οι νέες αναλυτικές τεχνικές και τα αναδυόμενα υπολογιστικά εργαλεία διευκολύνουν την παραπάνω προσπάθεια. Οι μεταβολομικές μελέτες που βασίζονται σε φασματομετρία μάζας υψηλής διακριτικής ικανότητας (HRMS) παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον για τις εφαρμογές της σύγχρονης τοξικολογίας. Οι μεταβολίτες είναι ενώσεις που έχουν καθολικές δομές και επιτρέπουν την μετάφραση της βιολογικής απόκρισης από το επίπεδο του πειραματόζωου στο επίπεδο του ανθρώπινου οργανισμού. Επίσης, το μεταβόλωμα περιγράφει με ακρίβεια έναν φαινότυπο ενδιαφέροντος και επομένως η μεταβολομική μελέτη επιτρέπει την βαθύτερη κατανόηση της βιοχημείας των εκφράσεων τοξικότητας, καθώς και την δημιουργία προβλεπτικών μοντέλων τοξικότητας. Βάσει των παραπάνω, η παρούσα διδακτορική διατριβή εστιάζει στην ανάπτυξη μεθοδολογιών μεταβολομικής ανάλυσης για την εύρεση βιοδεικτών που σχετίζονται με την έκφραση τοξικότητας. Το πρώτο μέρος της παρούσας διατριβής (Κεφάλαια 4 και 5) παρουσιάζει την διερεύνηση της νεφροτοξικότητας που επάγεται από την χορήγηση του αντικαρκινικού παράγοντα καρφιλζομίμπης (Cfz). Κατά το in-vivo πείραμα, σε 6 ποντίκια χορηγήθηκαν 8 mg/kg/μέρα Cfz (Cfz-group) και σε 6 ποντίκια χορηγήθηκε φυσιολογικός ορός (Control-group). Το πλάσμα, οι νεφροί και τα ούρα των ποντικών αναλύθηκαν με UPLC-HRMS-DIA μεθοδολογία. Για την ταξινόμηση των ομάδων και την επιλογή μεταβλητών χρησιμοποιήθηκε συνδυασμός πολυπαραμετρικών και μονοπαραμετρικών μεθοδολογιών. Για την ταυτοποίηση των μεταβολητών χρησιμοποιήθηκαν μεθοδολογίες μη στοχευμένης σάρωσης και σάρωσης ύποπτων ενώσεων. Επίσης, αναπτύχθηκαν post-hoc μεθοδολογίες για την διερεύνηση συσχετίσεων και αλληλεπιδράσεων ανάμεσα στους μεταβολίτες και τους διαφορετικούς τύπους βιοδειγμάτων. Η μελέτη απέδειξε την σοβαρή επίπτωση του φαρμάκου στους νεφρούς, μέσω της διατάραξης του νεφρικού μεταβολισμού που οδηγεί σε νεφρική δυσλειτουργία. Επιπλέον, ταυτοποιήθηκαν μεταβολίτες που σχετίζονται με την ουρεμία, το οξειδωτικό στρες, την φλεγμονή και την νεφρική ανεπάρκεια. Το δεύτερο μέρος της μελέτης (Κεφάλαιο 6) εστίασε στον προσδιορισμό πρώιμων αλλαγών στο μεταβολικό προφίλ παιδιών με καρκίνο, οι οποίες θα μπορούσαν να εξηγούν/ προβλέπουν τον κίνδυνο εμφάνισης καρδιοτοξικότητας, όταν οι ασθενείς υποβληθούν σε θεραπεία. Σε συνεργασία με την Ογκολογική – Αιματολογική Κλινική του Νοσοκομείου Παίδων «Αγία Σοφία» πραγματοποιήθηκαν δειγματοληψίες αίματος από ασθενείς, πριν την υποβολή τους σε χημειοθεραπεία. Οι ασθενείς ακολούθησαν το κατάλληλο θεραπευτικό πρωτόκολλο και κάποιοι (26) εμφάνισαν καρδιοτοξικότητα. Δείγματα πλάσματος αναλύθηκαν με UPLC-HRMS-DIA μεταβολομική ανάλυση και, η γνώση εμφάνισης τοξικότητας χρησιμοποιήθηκε για την ταξινόμηση των ασθενών σε Ομάδα Ρίσκου (CT-Risk) και ομάδα ελέγχου (No-Risk). Η μελέτη εστίασε στην διαδικασία επιλογής μεταβλητών συνδυάζοντας 4 συμπληρωματικές στατιστικές δοκιμασίες (KODAMA, OPLS-DA, BORUTA, t-test). Η βασική ιδέα ήταν πως μεταβλητές με καλή απόδοση σε παραπάνω από 3 δοκιμασίες έχουν αυξημένη πιθανότητα να σχετίζονται με το ρίσκο εμφάνισης καρδιοτοξικότητας, σύμφωνα με την θεωρεία του Bayes. Επιπλέον, η μελέτη έθεσε συγκεκριμένα κριτήρια εμπιστοσύνης για την ταυτοποίηση μεταβολιτών που προκύπτουν από DIA μεθοδολογίες λήψης φασμάτων. Η μελέτη ανέπτυξε μοντέλα ταυτοποίησης των CT-Risk ασθενών, με επιβεβαιωμένη προβλεπτική ικανότητα. Επιπλέον, οι ταυτοποιημένοι μεταβολίτες έδειξαν πρώιμη μεταβολή σε μεταβολικά μονοπάτια που συνδέονται με το γενικό μονοπάτι του καρδιακού μεταβολισμού για παραγωγή ενέργειας. Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν πως η χημειοθεραπεία επιδεινώνει ήδη υπάρχουσες ανωμαλίες της καρδιακής λειτουργίας και οδηγεί στην εκδήλωση καρδιοτοξικότητας. Τελευταίο μέρος της παρούσας διατριβής (Κεφάλαιο 7) αποτέλεσε η διερεύνηση της χορήγησης ανθρώπινης δόσης κολιστίνης σε ποντίκια. Στόχος ήταν η κατανόηση των βιοχημικών αιτιών που οδηγούν σε τοξικότητα λόγο του συγκεκριμένου φαρμάκου. Η κολιστίνη (CMS) είναι αντιβιοτικό τελευταίας επιλογής, και συνδέεται με σοβαρή νεύρο- και νέφροτοξικότητα. Θέλοντας να δούμε την επίπτωση του φαρμάκου στον οργανισμό σε συνθήκες που δεν υπάρχουν κλινικές ενδείξεις τοξικότητας, πραγματοποιήθηκε ένα in-vivo πείραμα: σε μία ομάδα ποντικών χορηγήθηκε 1 mg/kg/ ημέρα (LD-Group), σε μία ομάδα ποντικών χορηγήθηκαν 1.5 mg/kg/ ημέρα (HD-Group), και σε μία ομάδα ποντικών χορηγήθηκε φυσιολογικός ορός (Control). Το πλάσμα, οι νεφροί και το ήπαρ, χρησιμοποιήθηκαν για μεταβολομική ανάλυση με τη χρήση UPLC-HRMS-DIA μεθοδολογίας. Τα αποτελέσματα ταυτοποίησαν μεταβολίτες που ανταποκρίνονται στην αύξηση της δόσης. Επίσης εντοπίστηκε απορρύθμιση του μεταβολισμού της ντοπαμίνης και του μεταβολισμού των πουρινών στους νεφρούς. Ιδιαίτερη σημασία είχε η αύξηση της ξανθίνης στο επίπεδο των νεφρών, που επάγει τη δράση του ενζύμου ακετυλοχολινεστεράση, οδηγώντας σε ταχεία αποικοδόμηση της ακετυλοχολίνης, διαδικασία που θα μπορούσε να αποτελέσει συνδετικό κρίκο ανάμεσα στην νευροτοξικότητα και την νεφροτοξικότητα λόγω της χορήγησης κολιστίνης.