Αναγέννηση περιφερικών νεύρων με τη χρήση FK506 (tacrolimus) σε ικρίωμα κόλλας ινικής: πειραματική μελέτη σε επίμυες

Abstract

Aim: Nerve injuries with a gap represent a clinical challenge without a clear solution. Despite substantial improvement in microsurgical techniques for nerve repair, recovery after peripheral nerve injury usually remains incomplete. Tacrolimus (FK506), an FDA approved immunosuppressant, has been found to improve reinnervation and functional recovery following peripheral nerve injury in animal models. However, systemically delivered FK506 causes undesired immunosuppression. Aim of this study was to assess the efficacy of local FK506 delivery by means of a biodegradable fibrin gel conduit to improve outcomes in the setting of a rat sciatic nerve transection model. Methods: 40 Wistar rats were procured and equally distributed in 4 groups (A to D). After surgical preparation, in group A (SHAM), the left sciatic nerve was exposed through a gluteal incision and then the surgical wound was closed in layers without any further intervention. In group B (AUTO), the sciatic nerve was exposed, and a 10-mm section was transected. This nerve section was reversed in orientation and re-implanted in lieu of an autograft. In groups C (SLN) and D (FK506), the sciatic nerve was transected so as to create a 10-mm nerve gap. A fibrin conduit was prepared using a two-compound fibrin glue (Tisseel®). Fibrin glue was dispensed in a silicone mould around a stainless-steel core and pressed into shape for a few minutes. In group C, the fibrin conduit was mixed with normal saline, whereas in group D, the fibrin glue conduit was mixed with FK506. The conduits were subsequently used to bridge the nerve gap by being fixed to the nerve ends by 1-2 single epineurial sutures. Finally, surgical wounds were copiously irrigated and closed in layers in a regular fashion. Nerve regeneration was evaluated at 12 weeks following surgery by means of walking track analysis, electromyography and neurohistomorphometry. The resulting data was used for statistical analysis. Results: After completion of the aforementioned tests, retrieved results underwent statistical analysis. Descriptive statistics was used to express results as means standard deviations. Appropriate statistical tests were then used to identify differences between group means. Statistical analysis was conducted with the software GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, California, USA). Walking track analysis performed preoperatively, at 4, 8 and 12 weeks after surgery, demonstrated a gradual improvement in SFI (sciatic functional index). Preoperatively, values remained in normal-subnormal levels, as expected. In group A, as there was no nerve injury inflicted at any time, SFI values remained similar to preoperative values throughout the experiment. Group A values were also statistically better than all other groups at any time postoperatively. In all other groups, SFI was reduced significantly postoperatively, becoming strongly negative, prior to start recovering, fact indicative of the procured nerve injury and subsequent loss of function. The SFI increased over time after nerve injury within all groups. At 12 weeks, group D presented more favorable values to group C, difference found to be statistically significant. During electromyography, action potentials were demonstrated in all groups. The mean latency, amplitude and CMAP recovery index were measured at 12 weeks postoperatively. Group Α (sham) had the shortest latency, whereas group C (conduit alone) had the longest. Group D had more favorable values compared to group C but inferior as compared to group B. Group D demonstrated significantly better mean amplitude as compared to group C. Group D also demonstrated a significantly better CMAP recovery index than group C. Morphometric analysis was performed in sections from the distal nerve stump. The parameters measures included myelinated axon numberand nerve fiber diameter. Significant differences between the nerve areas were found in the distal nerve portion, with groups B and D performing significantly better than group C. Group B also outperformed group D, even though statistical difference was weaker. Conclusion: The use of fibrin gel conduit loaded with FK506 has had more favorable outcomes and faster functional recovery compared with a conduit without additives. The current study suggests that local delivery of FK506 with a biodegradable conduit can be effectively used to enhance peripheral nerve regeneration.

Σκοπός: Η παρούσα πειραματική μελέτη αποβλέπει στη δημιουργία ενός πειραματικού μοντέλου περιφερικής νευρικής βλάβης σε επίμυες, σε συνδυασμό με την τοπική χρήση FK506 εμποτισμένου σε γέλη ινικής ως ικρίωμα βραδείας αποδέσμευσης του φαρμάκου και ως νευροαγωγό στην περιοχή του νευρικού ελλείμματος. Μέθοδοι: Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήθηκε το μοντέλο πλήρους διατομής (νευρότμηση) του ισχιακού νεύρου σε επίμυες Wistar. Ο Υποψήφιος Διδάκτωρ προμηθεύτηκε 40 επίμυες Wistar της μελέτης, ηλικίας 6-9 εβδομάδων. Οι παραπάνω 40 επίμυες κατανεμήθηκαν ισοτίμως σε τέσσερις ομάδες (Group A, Group B, Group C και Group D) [10 επίμυες σε κάθε ομάδα]. Στην πρώτη ομάδα [Group A (SHAM)], μετά την προσπέλαση και την παρασκευή του ισχιακού νεύρου, δεν διενεργήθηκε κάποια παρέμβαση σε αυτό και ακολούθησε άμεσα η σύγκλειση του τραύματος κατά στρώματα (sham surgery). Στη δεύτερη ομάδα [Group B (AUTO)], οι επίμυες υπέστησαν πλήρη διατομή του ισχιακού νεύρου σε δύο σημεία αυτού, έτσι ώστε να αφαιρεθεί νευρικό μόσχευμα 10 mm και να προκύψει ισότιμο νευρικό έλλειμμα στο ισχιακό νεύρο των επιμύων. Το νευρικό μόσχευμα, επανατοποθετήθηκε με αντίθετη φορά (επαναπροσανατολισμός 180ο) στο νευρικό έλλειμμα για να προσομοιάσει την εφαρμογή νευρικού αυτομοσχεύματος (reverse autograft). Στην τρίτη ομάδα [Group C (SLN)] και στην ομάδα πειραματισμού [Group D (FK506)], οι επίμυες υπέστησαν πλήρη διατομή του ισχιακού νεύρου στη μεσότητα αυτού (μέσο σημείο μεταξύ σπονδυλικής στήλης και τριχασμού) και πρόκληση νευρικού ελλείμματος 10 mm. Το νευρικό έλλειμμα, εν συνεχεία, γεφυρώθηκε με αυτοσχέδιο νευρικό οδηγό κατασκευασμένο από γέλη ινικής (Tisseel®). Στην τρίτη ομάδα (Group C), εντός του νευροαγωγού τοποθετήθηκε φυσιολογικός ορός. Ωστόσο, στην πειραματική ομάδα (Group D), η γέλη ινικής προτού μετατραπεί σε σταθερή γέλη αναμίχθηκε με FK506. Η αξιολόγηση του βαθμού της νευρικής αναγέννησης έγινε με (1) ανάλυση βάδισης προεγχειρητικά, καθώς και 4, 8 και 12 εβδομάδες μετεγχειρητικά, (2) ηλεκτροφυσιολογικό έλεγχο πριν τη θανάτωση των πειραματοζώων 12 εβδομάδες μετεγχειρητικά, και (3) ιστολογική εξέταση με νευροϊστομορφομετρία μετά τη θανάτωση των επίμυων, 12 εβδομάδες μετεγχειρητικά. Τέλος, ακολούθησε καταγραφή και στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων που προέκυψαν από τις λειτουργικές δοκιμασίες. Αποτελέσματα: Μετά την ολοκλήρωση των προαναφερθέντων λειτουργικών δοκιμασιών και την καταγραφή των αποτελεσμάτων στα πειραματόζωα, ακολούθησε η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων. Η επεξεργασία των δεδομένων που προέκυψαν από τις άνωθι δοκιμασίες περιλάμβανε περιγραφική στατιστική ανάλυση για τον υπολογισμό μέσης τιμής σταθερής απόκλισης, καθώς και χρήση κατάλληλων στατιστικών δοκιμασιών, προκειμένου να διαπιστωθεί αν υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των υπό εξέταση ομάδων. Οι τιμές που συλλέχθηκαν υποβλήθηκαν σε στατιστικά ανάλυση με το λογισμικό GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, California, USA). Η ανάλυση βάδισης κατέδειξε σταδιακή βελτίωση των τιμών του SFI (sciatic functional index). Προεγχειρητικά, οι τιμές κυμάνθηκαν κοντά σε φυσιολογικά επίπεδα. Καθότι στην ομάδα Α (sham surgery group) δεν προκλήθηκε εσκεμμένα κάκωση του ισχιακού νεύρου όπως στις υπόλοιπες ομάδες, οι τιμές αυτές παρέμειναν σχετικά σταθερές μετεγχειρητικά. Η ομάδα Α υπερτερούσε των υπολοίπων με στατιστικά σημαντική διαφορά σε όλες τις μετεγχειρητικές χρονικές περιόδους. Στις υπόλοιπες ομάδες, οι τιμές του SFI μειώθηκαν σημαντικά μετεγχειρητικά, όπου και έγιναν ισχυρά αρνητικές, γεγονός που αποτελεί ένδειξη απώλειας λειτουργικότητας κατόπιν νευρικής βλάβης. Οι τιμές αυτές αυξήθηκαν κατά την πάροδο του χρόνου, παρουσιάζοντας στατιστικά σημαντική βελτίωση εντός κάθε ομάδας. Με το πέρας των 12 εβδομάδων, η ομάδα D (FK506) παρουσίασε εντονότερη βελτίωση του SFI σε σχέση με την ομάδα C (νευρικός αγωγός με φυσιολογικό ορό, χωρίς FK506), διαφορά η οποία ήταν στατιστικά σημαντική. Κατά την ηλεκτρομυογραφία, ήταν παρόντα δυναμικά επανανεύρωσης σε όλα τα πειραματόζωα. Ο ηλεκτροφυσιολογικός έλεγχος του λανθάνοντα χρόνου (latency), του εύρους (amplitude), καθώς και του CMAP recovery index (λόγος amplitude μεταξύ χειρουργημένου και φυσιολογικού άκρου), επίσης κατέγραψε σημαντικές διαφορές μεταξύ των ελεγχόμενων ομάδων. Η ομάδα Α (sham) παρουσίασε τον μικρότερο λανθάνοντα χρόνο, ενώ η ομάδα C (νευρικός αγωγός με ορό) παρουσίασε τον μεγαλύτερο. Η ομάδα D είχε στατιστικά σημαντική ευνοϊκότερη τιμή σε σχέση με την ομάδα C (SLN). Η ομάδα Β υπερείχε της ομάδας D, αν και με λιγότερο ισχυρή στατιστικά σημαντική διαφορά. Σε ό,τι αφορά το εύρος των προκλητών δυναμικών (amplitude), η πειραματική ομάδα D είχε σημαντικά καλύτερη επίδοση από την ομάδα C, ενώ τα αποτελέσματα ήταν στατιστικά σημαντικά. Αντιθέτως, οι ομάδες B και D δεν παρουσίασαν στατιστικά σημαντική διαφορά. Τέλος, σχετικά με το CMAP recovery index, το group D παρουσίασε στατιστικά σημαντική διαφορά μόνο σε σχέση των αποτελεσμάτων της ομάδας C, η οποία είχε χειρότερη επίδοση. Η μορφομετρική ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε τομές από το περιφερικό κολόβωμα. Οι μετρήσεις περιλάμβαναν δεδομένα σχετικά με τον συνολικό αριθμό των νευραξόνων και την διάμετρο των νευρικών ινών. Οι ληφθείσες μετρήσεις από το περιφερικό κολόβωμα παρουσίασαν στατιστικά σημαντικές διαφορές, με τις ομάδες Β και D υπερτερούν σημαντικά της ομάδας C σε ό,τι αφορά και στις 2 παραμέτρους υπό εξέταση. Οι ομάδες C και D παρουσίασαν ισχυρή διαφορά στον αριθμό των εμμύελων ινών, με την ομάδα D υπερτερεί. Η ομάδα B είχε καλύτερη επίδοση από την ομάδα D, αν και η διαφορά αυτή ήταν λιγότερο ισχυρή στατιστικά. H διάμετρος των νευρικών ινών, αντιθέτως, δεν εμφάνισε στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των group B και D. Στην ίδια κατηγορία, το group C βρέθηκε σημαντικά ασθενέστερο στατιστικά από τις άλλες 2 πειραματικές ομάδες (B και D). Συμπέρασμα: Η χρήση νευρικού αγωγού εμποτισμένου με FK506 παρουσίασε ευνοϊκότερα αποτελέσματα και γρηγορότερη αποκατάσταση σε σχέση με τον νευρικό αγωγό χωρίς πρόσθετα. Η παρούσα μελέτη επιβεβαιώνει τη δυνητική αξία της τοπικής χορήγησης FK506 μέσω βιοδιασπώμενου νευρικού αγωγού, για την επιτάχυνση της νευρικής αναγέννησης.