Ο ρόλος της κυτταρικής γήρανσης στη μη αλκοολική λιπώδη νόσο του ήπατος (NAFLD)

Abstract

Background: Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is the most predominant cause of chronic liver disease worldwide. The pathogenetic mechanisms involved in the progression of NAFLD have not been completely elucidated, while the circulating cell-free DNA (cfDNA) species have been implicated in a plethora of inflammatory diseases and malignancies. The significance of cfDNA species has been rarely evaluated in NAFLD while the assessment of the role of cellular senescence in the progression of NAFLD is of high clinical interest. In the current study, we aim to evaluate the role of both senescence and cfDNA species in the progression of NAFLD to non-alcoholic steatohepatitis (NASH) and liver cirrhosis. Methodology: In this cohort study, forty-nine adult patients with NAFLD of any stage ranging from simple steatosis (n=10) to NASH (n=23) and cirrhosis (n=16) were included. CfDNA was isolated from patients’ sera and the levels of several distinct cfDNA species including total cfDNA, gene-coding cfDNA, Alu repeat sequences and mitochondrial DNA copies were determined. Moreover, we evaluated the global methylation of cfDNA as assessed by the levels of 5-methyl-2′-deoxycytidine as well as the gene specific methylation of CDKN1A (p21), CDKN2A (p16) και RB1 genes, all of which are major regulators of cellular senescence. Results: Cirrhotic compared to non-cirrhotic patients had significantly lower serum levels of cfDNA (72.6 vs. 27.9 ng/mL, p = 0.002) and RNAse P coding DNA (70.2 vs. 39.9 GEs, p < 0.001) as well as higher expression of 5-methyl-2′-deoxycytidine (170.3 vs. 145.1 ng/mL, p = 0.029). After adjustment for the significant clinico-epidemiological factors, lower serum levels of cfDNA or RNAse P were independently associated with the presence of cirrhosis. Moreover, cirrhotic patients had significantly lower mean methylation of RB1 gene in serum as compared to non-cirrhotic patients (0.77% vs 1.08%, p=0.050), whereas patients with NASH or NASH-associated cirrhosis had remarkably decreased mean methylation of CDKN1A (p21) gene in serum in comparison to their counterparts with isolated steatosis (1.16% vs 2.62%, p=0.025).Conclusions: In conclusion, serum levels of total and gene-coding DNA are associated with the presence of cirrhosis in NAFLD patients regardless of clinical or epidemiological parameters and may therefore be used as a screening tool for NAFLD progression. Additionally, the CDKN1A (p21), CDKN12A (p16) and RB1 genes, major regulatory molecules of cellular senescence, seem to be implicated in the progression of NAFLD to NASH and cirrhosis.

Υπόβαθρο: Η μη αλκοολική λιπώδης νόσος του ήπατος (NAFLD) αποτελεί την πιο συχνή αιτία χρόνιας ηπατικής νόσου στον κόσμο. Οι παθογενετικοί μηχανισμοί που εμπλέκονται στην παθογένεση της NAFLD δεν έχουν πλήρως διαλευκανθεί, ενώ τα κυκλοφορούντα είδη του ελεύθερου-κυττάρου DNA [cell-free DNA (cfDNA)] εμπλέκονται σε πληθώρα φλεγμονωδών νόσων και κακοήθων νοσημάτων. Η σημασία των ειδών του cell-free DNA στην πρόοδο της NAFLD δεν έχει αξιολογηθεί επαρκώς ενώ η εμπλοκή της κυτταρικής γήρανσης στην πρόοδο της νόσου αποτελεί ένα σημείο υψηλού κλινικού ενδιαφέροντος. Στην παρούσα διατριβή σκοπεύουμε να μελετήσουμε το ρόλο της κυτταρικής γήρανσης καθώς και των κυκλοφορούντων ειδών του cfDNA στην πρόοδο της NAFLD σε μη αλκοολική στεατοηπατίτιδα (NASH) και κίρρωση. Μεθοδολογία: Σαράντα εννέα ασθενείς με NAFLD σε όλο το φάσμα της νόσου, από απλή λιπώδη νόσο (ν=10), στεατοηπατίτιδα (ν=23) και κίρρωση (ν=16) συμπεριελήφθησαν στην παρούσα προοπτική μελέτη. Το ελεύθερο-κυττάρου DNA απομονώθηκε από τους ορούς των ασθενών και τα επίπεδα διαφόρων κατηγοριών του, δηλαδή του ολικού, του κωδικοποιούντος DNA, των μεταθετών αλληλουχιών Alu και των αντιγράφων του μιτοχονδριακού DNA ποσοτικοποιήθηκαν. Επιπλέον, αξιολογήθηκε τόσο η συνολική μεθυλίωση του DNA με την αξιολόγηση των επιπέδων της 5-μεθυλο-2’-δεοξυκυτιδίνης καθώς και η μεθυλίωση των γονιδίων CDKN1A (p21), CDKN2A (p16) και RB1 που είναι μείζονες ρυθμιστές της κυτταρικής γήρανσης. Αποτελέσματα: Οι κιρρωτικοί σε σχέση με τους μη κιρρωτικούς ασθενείς είχαν σημαντικά μειωμένα επίπεδα ολικού cfDNA (72.6 vs. 27.9 ng/mL, p = 0.002) και κωδικοποιούντος cfDNA (70.2 vs. 39.9 GEs, p < 0.001) και υψηλότερη έκφραση της 5-μεθυλο-2΄-δεοξυκυτιδίνης (170.3 vs. 145.1 ng/mL, p = 0.029). Τα επίπεδα τόσο του ολικού όσο και του κωδικοποιούντος cfDNA σχετίζονται σημαντικά με την κίρρωση ακόμα και μετά τη στάθμιση για σημαντικούς κλινικο-επιδημιολογικούς παράγοντες. Επιπλέον, οι κιρρωτικοί ασθενείς παρουσίασαν στατιστικά σημαντικά μειωμένη μεθυλίωση του γονιδίου RB1 (0.77% vs 1.08%, p=0.050) στον ορό σε σχέση με τους μη κιρρωτικούς, ενώ οι ασθενείς με NASH με ή χωρίς κίρρωση είχαν σημαντικά μειωμένη μεθυλίωση του CDKN1A (p21) γονιδίου στον ορό σε σχέση με τους ασθενείς με απλή στεάτωση (1.16% vs 2.62%, p=0.025). Συμπεράσματα: Συμπερασματικά, η συσχέτιση των επιπέδων του ολικού και κωδικοποιούντος cfDNA με την κίρρωση στους ασθενείς με NAFLD είναι ανεξάρτητη κλινικών ή επιδημιολογικών παραγόντων και έτσι μπορούν ίσως να αποτελέσουν ένα διαγνωστικό μέσο της προόδου της νόσου. Επιπρόσθετα, τα γονίδια CDKN1A, CDKN2A, RB1, χαρακτηριστικοί ρυθμιστές της γήρανσης, φαίνεται να εμπλέκονται στην πρόοδο και εξέλιξη της NAFLD σε στεατοηπατίτιδα και κίρρωση.