Ανάπτυξη μεθόδων πρόβλεψης της οικοτοξικολογικής συμπεριφοράς αναδυόμενων ρυπαντών (emerging pollutants)

Abstract

The subject of the present PhD thesis is the development of methods for the prediction of the toxicological behavior of emerging pollutants in the environment. Emerging pollutants are defined as potentially toxic substances, which are not naturally found in the environment, but nevertheless have the potential to enter it (e.g. pesticides, medicines, personal care products, etc.). The environmental toxicity of interest to this PhD thesis refers to the environmental mobility of emerging pollutants in living organisms (bioaccumulation), as well as their effects (e.g. lethal or effective concentration) on them, while the study focuses on water organisms, which are the final recipient of the given pollution. The aim of the PhD thesis is the development of innovative methods based on biomimetic chromatography, which can be proposed as reliable tools for the prediction and assessment of the environmental risk of emerging pollutants. Biomimetic chromatography uses columns with immobilized biomolecules on a silica skeleton or biomolecule simulants (micelles) in the mobile phase in reversed phase chromatography. The original hypothesis is based on the fact that the different types of lipophilicity measured by biomimetic chromatography which govern the various biological and pharmacokinetic phenomena, could also describe phenomena resulting from the interaction of xenobiotics with biological organisms and subsequently the development of toxicity on them. The traditionally used octanol-water partition coefficient applied for the prediction of the ecotoxicity of organic compounds has many disadvantages, such as its difficult, time-consuming and laborious experimental determination, the inability to automate its measurement, as well as its questionability as a model for simulating biological interactions. On the other hand, biomimetic chromatography simulates biological systems with real biomolecules or their surrogates, offers fast measurements, is user-friendly and can be automated for routine analysis. Biomimetic chromatographic methods used in the doctoral thesis are immobilized artificial membrane chromatography (IAM: Immobilized Artificial Membrane), immobilized plasma protein chromatography (human serum albumin protein - HSA: Human Serum Albumin and α1-acid glycoprotein - AGP: a1-Acid Glycoprotein), as well as micellar liquid chromatography using anionic, cationic and nonionic surfactants. A literature collection of data on various types of environmental toxicity of emerging pollutants (BCF: Bioconcentration Factor, LC50: Lethal Concentration 50% /EC50: Effective Concentration 50%) in reference to aquatic organisms typically used in ecotoxicological studies, such as fish, daphnia (daphnia magna) and molluscs (crassotrea virginica), is also conducted. Due to the fact that environmental toxicity is a complex process, additional physicochemical data of the emerging pollutants under study are collected, such as their molecular mass, topological polar surface, molar ionization fractions in aqueous environment, their ability of hydrogen bonding, etc. Data are processed using modern statistical/chemometric methods (MLR: Multiple Linear Regression, principal component analysis, PCA: Principal Component Analysis) and predictive models of the ecotoxicological effect of emerging pollutants on reference aquatic organisms are constructed. In this thesis a systematic investigation of the behavior of a range of pharmaceuticals, pesticides and UV-filter compounds used in sunscreens under different biomimetic chromatographic conditions has been carried out. Through the application of statistical/chemometric techniques, biomimetic chromatographic retention has been correlated with ecotoxicological data (lethal dose/concentration, bioconcentration) collected from authoritative databases, such as the US Environmental Protection Agency (US EPA) and the European Chemical Products Agency (ECHA: European Chemicals Agency). Ecotoxicity prediction models have been validated using appropriate test sets. The originality of the doctoral thesis can be summarized to the following points:• Acquisition of primary biomimetic chromatographic data of organic pollutants (drugs, pesticides and sunscreen agents) using IAM, AGP and HSA chromatography. Especially for pesticides and sunscreen agents, there is no reference in the literature regarding measurements of these compounds with the aforementioned biomimetic columns.• Obtaining primary biomimetic chromatographic data of pesticides, drugs and UV-filter compounds using micellar liquid chromatography (MLC), while simultaneously investigating the effect of different surfactants on the ability to biosimulate and predict ecotoxicity. More specifically, three surfactants were investigated, the neutral Brij-35 (Polyoxyethylene Lauryl Ether), the anionic SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) and the cationic CTAB (Cetrimonium Bromide). There are few references in the literature for the use of this particular type of chromatography in environmental science and these are limited to the use of the neutral surfactant Brij-35. • Development of original quantitative retention-activity relationships (QRAR: Quantitative Retention-Activity Relationships) for the prediction of ecotoxicity, based on the information of each chromatographic retention. The development of QRARs resulted from the correlation of chromatographic data with various toxicity indices, such as acute toxicity (LC50, EC50) and bioaccumulation tendency (BCF), with respect to various reference aquatic organisms (fish, daphnia, molluscs) collected from the literature. • Finding the most appropriate predictor of ecotoxicity in each case and for each organism. To this end, the predictive ability of the models was also compared to that of models based on the traditional octanol-water partition index (logP), as well as to the predictions of the US EPA's widely accepted EPI Suite environmental risk prediction software. By proving that ecotoxicological predictions based on biomimetic chromatographic properties are superior to those based on logP and to the predictions of EPI Suite software, new and more accurate tools for predicting the ecotoxicity of emerging pollutants are proposed.

Αντικείμενο της διδακτορικής διατριβής αποτελεί η ανάπτυξη μεθόδων για την πρόβλεψη της τοξικολογικής συμπεριφοράς αναδυόμενων ρυπαντών στο περιβάλλον. Ως αναδυόμενοι ρυπαντές ορίζονται δυνητικά τοξικές ουσίες, οι οποίες δε βρίσκονται φυσικά στο περιβάλλον, αλλά παρ’όλα αυτά έχουν τη δυνατότητα να εισέλθουν σε αυτό (πχ. φυτοφάρμακα, φάρμακα, είδη προσωπικής φροντίδας κ.ά.). Η περιβαλλοντική τοξικότητα που ενδιαφέρει την παρούσα διδακτορική διατριβή αναφέρεται στην περιβαλλοντική ευκινησία των αναδυόμενων ρυπαντών σε ζώντες οργανισμούς (βιοσυσσώρευση), καθώς και στις επιπτώσεις τους (π.χ. θανατηφόρα ή αποτελεσματική συγκέντρωση) σε αυτούς, ενώ η μελέτη επικεντρώνεται σε υδατικά συστήματα, τα οποία αποτελούν και τον τελικό αποδέκτη της δεδομένης ρύπανσης. Στόχος της Διδακτορικής Διατριβής είναι η ανάπτυξη καινοτόμων μεθόδων με βάση την βιομιμητική χρωματογραφία, οι οποίες να μπορούν να προταθούν ως αξιόπιστα εργαλεία πρόβλεψης και εκτίμησης του περιβαλλοντικού κινδύνου αναδυόμενων ρυπαντών. Στη βιομιμητική χρωματογραφία χρησιμοποιούνται στήλες με ακινητοποιημένα βιομόρια σε σκελετό πυριτίας ή προσομοιωτές βιομορίων (μικκύλια) στην κινητή φάση σε χρωματογραφία αντιστρόφου φάσεως. Η αρχική υπόθεση βασίζεται στο γεγονός ότι τα διάφορα είδη λιποφιλίας που μετρώνται με τη βιομιμητική χρωματογραφία και τα οποία διέπουν τα διάφορα βιολογικά και φαρμακοκινητικά φαινόμενα, μπορούν να περιγράψουν και φαινόμενα που προκύπτουν από την αλληλεπίδραση ξενοβιοτικών με βιολογικούς οργανισμούς και κατ’επέκταση την εμφάνιση τοξικότητας σε αυτούς. Ο παραδοσιακά χρησιμοποιούμενος δείκτης μερισμού οκτανόλης-νερού που εφαρμόζεται στην πρόβλεψη της οικοτοξικότητας οργανικών ενώσεων έχει πολλά μειονεκτήματα, όπως το δύσκολο, χρονοβόρο και κοπιαστικό πειραματικό προσδιορισμό του, την αδυναμία αυτοματοποίησης της μέτρησής του, καθώς και την αμφισβήτησή του ως μοντέλου προσομοίωσης βιολογικών αλληλεπιδράσεων. Επιπρόσθετα, η υπολογιστική πρόβλεψη του δείκτη οκτανόλης-νερού μέσω λογισμικών παρουσιάζει μεγάλες αποκλίσεις ως προς τις εκτιμώνες τιμές ανάλογα με τον αλγόριθμο στον οποίο βασίζεται η εκάστοτε πρόβλεψη. Αντίθετα, η βιομιμητική χρωματογραφία προσομοιάζει βιολογικά συστήματα με πραγματικά βιομόρια ή υποκατάστατα αυτών, παρέχει μετρήσεις αλληλεπίδρασης μεταξύ βιομορίων και ξενοβιοτικών σε πραγματικό χρόνο, ενώ ταυτόχρονα προσφέρει γρήγορες μετρήσεις, είναι φιλική προς το χρήστη και μπορεί να αυτοματοποιηθεί για μετρήσεις ρουτίνας.Βιομιμητικές χρωματογραφικές μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν στα πλαίσια της διδακτορικής διατριβής είναι η χρωματογραφία ακινητοποιημένων τεχνητών μεμβρανών (IAM: Immobilized Artificial Membrane), η χρωματογραφία ακινητοποιημένων πρωτεινών (πρωτεΐνη λευκωματίνης ανθρωπίνου ορού – HSA: Human Serum Albumin και α1-όξινης γλυκοπρωτεΐνης – AGP: a1-Acid Glycoprotein), καθώς και η μικκυλιακή υγροχρωματογραφία με χρήση ανιοντικών, κατιοντικών και μη ιοντικών τασιενεργών. Πραγματοποιείται επίσης βιβλιογραφική συλλογή δεδομένων διαφόρων ειδών περιβαλλοντικής τοξικότητας των αναδυόμενων ρυπαντών (συντελεστής βιοσυσσώρευσης– BCF: Bioconcentration Factor, θανατηφόρα/αποτελεσματική συγκέντρωση– LC50: Lethal Concentration 50% /EC50: Effective Concentration 50%) σε υδρόβιους οργανισμούς αναφοράς χαρακτηριστικούς σε οικοτοξικολογικές μελέτες, όπως ψάρια, δάφνια (daphnia magna) και μαλάκια (crassotrea virginica). Επειδή η περιβαλλοντική τοξικότητα αποτελεί μια πολύπλοκη διεργασία συλλέγονται επιπλέον φυσικοχημικά δεδομένα των υπό μελέτη αναδυόμενων ρυπαντών, όπως η μοριακή τους μάζα, η τοπολογική πολική τους επιφάνεια, τα μοριακά ποσοστά ιοντισμού τους σε υδατικό περιβάλλον, η δημιουργία δεσμών υδρογόνου κ.ά. Τα δεδομένα επεξεργάζονται με χρήση σύγχρονων στατιστικών/χημειομετρικών μεθόδων (πολλαπλή γραμμική παλινδόμηση – MLR: Multiple Linear Regression, ανάλυση κυρίων συνιστωσών – PCA: Principal Component Analysis) και καταστρώνονται μοντέλα πρόβλεψης της οικοτοξικολογικής δράσης των αναδυόμενων ρύπων σε υδρόβιους οργανισμούς αναφοράς, οι οποίοι χρησιμοποιούνται σε δοκιμές οικοτοξικότητας. Στην παρούσα διατριβή έχει πραγματοποιηθεί συστηματική διερεύνηση της συμπεριφοράς ενός εύρους φαρμακευτικών ενώσεων, φυτοφαρμάκων και ενώσεων UV-φίλτρων που χρησιμοποιούνται σε αντιηλικές κρέμες σε διαφορετικές βιομιμητικές χρωματογραφικές συνθήκες. Μέσω εφαρμογής στατιστικών/χημειομετρικών τεχνικών έχουν συσχετίθεί βιομιμητικοί χρωματογραφικοί δείκτες με οικοτοξικολογικά δεδομένα (θανατηφόρος δόση/συγκέντρωση, τάση βιοσυσσώρευσης) που έχουν συλλεχθεί από έγκριτες βάσεις δεδομένων, όπως η Υπηρεσία Προστασίας Περιβάλλοντος των ΗΠΑ (US EPA: US Environmental Protection Agency) και ο Ευρωπαϊκός Οργανισμός Χημικών Προϊόντων (ECHA: European Chemicals Agency). Τα μοντέλα πρόβλεψης της οικοτοξικότητας έχουν επικυρωθεί χρησιμοποιώντας κατάλληλα δεδομένα ελέγχου (test set). Η πρωτοτυπία της διδακτορικής διατριβής αφορά τα εξής σημεία: •Λήψη πρωτογενών βιομιμητικών χρωματογραφικών δεδομένων οργανικών ρύπων (φαρμάκων, φυτοφαρμάκων και αντιηλιακών παραγόντων) με τη χρήση χρωματογραφίας ΙΑΜ, AGP και HSA. Ιδίως όσον αφορά τα φυτοφάρμακα και τους αντιηλιακούς παράγοντες, δεν υπάρχει αναφορά σε μετρήσεις αυτών των ενώσεων με τις βιομιμητικές στήλες στη βιβλιογραφία. •Λήψη πρωτογενών βιομιμητικών χρωματογραφικών δεδομένων φυτοφαρμάκων, φαρμάκων και ενώσεων UV-φίλτρων με τη χρήση μικκυλιακής χρωματογραφίας (MLC: Micellar Liquid Chromatography), διερευνώντας ταυτόχρονα την επίδραση διαφορετικών τασιενεργών στην ικανότητα βιολογικής προσομοίωσης και πρόβλεψης της οικοτοξικότητας. Πιο συγκεκριμένα, πραγματοποιήθηκε διερεύνηση τριών τασιενεργών, του ουδέτερου Brij-35 (Polyoxyethylene Lauryl Ether), του ανιοντικού SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) και του κατιοντικού CTAB (Cetrimonium Bromide). Λίγες είναι οι αναφορές στη βιβλιογραφία για τη χρήση του συγκεκριμένου είδους χρωματογραφίας στην περιβαλλοντική επιστήμη και αυτές περιορίζονται στην χρήση του ουδέτερου τασιενεργού Brij-35. •Ανάπτυξη πρωτότυπων ποσοτικών σχέσεων κατακράτησης-δράσης (QRAR: Quantitative Retention-Activity Relationships) για την πρόβλεψη της οικοτοξικότητας, βασισμένων στην πληροφορία της εκάστοτε χρωματογραφικής κατακράτησης. Η ανάπτυξη των QRAR προέκυψε από συσχέτιση των χρωματογραφικών δεδομένων με διάφορους δείκτες τοξικότητας, όπως οξείας τοξικότητας (LC50, EC50) και τάσης βιοσυσσώρεσης (BCF), αναφορικά με διάφορους υδρόβιους οργανισμούς αναφοράς (ψάρια, δάφνια, μαλάκια) που συλλέχθησαν από τη βιβλιογραφία. •Εύρεση του καταλληλότερου δείκτη πρόβλεψης της οικοτοξικότητας σε κάθε περίπτωση και για κάθε οργανισμό. Για το σκοπό αυτό, η προβλεπτική ικανότητα των μοντέλων συγκρίθηκε και με αυτή των μοντέλων που βασίζονται στον παραδοσιακό δείκτη μερισμού οκτανόλης-νερού (logP), καθώς και με τις προβλέψεις του ευρέως αποδεκτού λογισμικού πρόβλεψης περιβαλλοντικού κινδύνου EPI Suite της US EPA. Με την απόδειξη της υπεροχής των προβλέψεων οικοτοξικότητας μέσω της χρήσης των βιομιμητικών χρωματογραφικών δεικτών έναντι των προβλέψεων με βάση το logP και των προβλέψεων του EPI Suite, προτείνονται νέα και πιο ακριβή εργαλεία για την πρόβλεψη της οικοτοξικότητας αναδυόμενων ρύπων.