Σύνθεση νέων βιοδραστικών μορίων και ανάπτυξη συστημάτων εγκλεισμού τους σε νανοφορείς

Abstract

The aim of the doctoral thesis was initially the development of a “chemical library” of novel, synthetic analogues of quinazolinones family and aurones. The “chemical library” was developed to study the relationship between the chemical structure and biological activity. The structurally modified analogues that showed promising in vitro biological activity were then encapsulated in biodegradable carriers. In the present PhD thesis the design, synthesis and characterization of quinazolinones and aurones analogues, most of them new to the literature, were achieved. The compounds were identified through nuclear magnetic resonance spectroscopy (1H and 13C NMR), high resolution mass spectrometry (HR-MS) and Fourier-transform infrared spectroscopy (FT-IR).Specifically, five series of quinazolinones derivatives A, B, C, D and E were designed. Series A includes the analogues of 3-amino-2-methyl-6,7-substituted quinazolinones which were synthesized in two steps using microwave irradiation as method more environmentally friendly. Series A was also enriched with 2-methyl-3,6,7-substituted quinazolinone derivatives by modifying the 3-position of the quinazoline ring using diamines. Series B includes Schiff bases quinazolinone derivatives of with the main structural component being the presence of a double bond at position 3 and was designed to study the structure-biological activity relationship, specifically the presence of the double bond. The synthesis of Schiff bases involves three steps initially the cyclization of anthranilic acid to a suitable substituted benzoxazinone. Then follows the addition of hydrazine hydrate and finally the addition of appropriately substituted benzaldehyde catalyzed by piperidine. Series C comprises amide quinazolinone derivatives with the main structural component being the presence of an amide group in the 3-position. The synthesis involves 3 steps, first the cyclization of the anthranilic acid to an appropriate substituted benzoxazinone and then the addition of hydrazine hydrate to form the Series A derivatives using microwave radiation and finally the addition of acetyl chloride for the synthesis of the derivatives of this series. It is noted that the third stage according to the literature references was performed with conventional heating but was also studied with the introduction of microwave radiation. Series D, E and F comprise the second major family of quinazoline derivatives of 2,3-disubstituted quinazolinones. More specifically, these Series include quinazoline derivatives synthesized in one step through a multicomponent reaction (MCR) and the use of natural deep eutectic solvents (NADES) as solvents and catalysts of these reactions and the use of high energy techniques to optimize the methodology. The use of NADES was chosen as more environmentally friendly solvents, since as non-toxic they replace toxic organic solvents while at the same time they also act as catalysts improving the yields of the final products. It is noted that this methodology developed has several advantages and due to the MCR reaction where it is possible to produce chemical libraries of bioactive molecules from simple raw materials without isolating intermediate compounds, adding extra reactants and solvents, etc. More specifically, Series D includes derivatives of 2,3-disubstituted quinazolinones where they were synthesized in one step by addition of isotoic anhydride, appropriately substituted aniline, appropriately substituted benzaldehyde and NADES as solvent and reaction catalyst. It is noted that in addition to the development of the chemical library, a study of the catalytic action of 20 different NADES was carried out in order to find the optimal conditions for this methodology. Series E respectively comprises 2,3-disubstituted quinazolinones which were synthesized in one step by the addition of hydrazine isotoic anhydride and an appropriately substituted aldehyde. For the design of a more environmentally friendly methodology, the addition of a suitable NADES was carried out using ultrasound to optimize the methodology. Series F includes corresponding derivatives which were synthesized in one step by the addition of isoic anhydride, appropriately substituted aniline, cinnamic chloride and selected NADES. Finally, Series H and Z include the series of chalcones and aurones respectively. The synthesis of selected chalcones and auronwa was chosen to study the structure-activity relationship, as aurones have the ability to interact with DNA as DNA intercalators. Thus, it was considered appropriate to test them for their potential ability to photocleavage DNA, as possible photosensitizers. Initially, the synthesis of Series H involves the synthesis of chalcones via a Claisen-Schmidt condensation reaction between appropriately substituted hydroxy-acetophenones and appropriately substituted benzaldehydes under basic conditions. Then, follows the synthesis of Series H involving the oxidative cyclization of the corresponding chalcones using mercury (II) acetate as an oxidizing agent. Subsequently, the relationship between structure and in vitro biological activity was studied for the synthesized quinazoline derivatives and aurones. More specifically, the new derivatives were evaluated for their ability to interact with DNA, their ability to degrade DNA under the influence of radiation as well as their antioxidant activity through their ability to interact with the DPPH free radical. The evaluation yielded significant results for the structure-biological activity relationship. Some of the derivatives showed significant antioxidant activity, more specifically the derivatives of Series A, D, E that carry a hydroxy group in the quinazolinone ring seem to significantly improve the antioxidant activity. Regarding the study of their interaction with DNA, the computational results and the results of the titration of the molecules and their interaction with thymus DNA (CT-DNA) appeared to be similar noting that quinazolinone analogues show external interaction in the small or major groove of DNA. Regarding the structure-activity relationship, it seems that the substituents of halogen-groups, nitro-groups, hydroxy-groups, methoxy groups in some derivatives are decisive for their interaction with DNA as it was also seen from the computational data that they displayed a stronger interaction forming hydrogen bonds. Also, quinazolinone derivatives were studied and evaluated for their ability to photocleave DNA as potential photosensitizers for use in treatments such as cancer, skin diseases (for examples psoriasis, acne etc.) as well as antimicrobials. In particular, the quinazoline derivatives were studied in terms of positions 3, 6 and the role of the substituents in these positions. In particular, the presence and absence of an amino group at position 3 was studied as well as the elongation of the aliphatic group at this position, where it appeared to be a determining factor for the activity. Also, substituents in position 6 such as halogen-group, nitro-group, hydroxy-group show high rates of photocleavage activity. For the series of dihydroquinazolinones, an important structural factor was the existence of halogen-groups and nitro-groups as substitutes for the aromatic rings in position 2 and 3 of the quinazoline ring. Below are some derivatives that can be “lead” molecule for their interaction and mode of action with DNA. Some of these derivatives are presented below. At the same time, green solvents and specifically natural deep eutectic solvents (NaDES) were used to improve the synthesis reactions giving a greener character to these reactions. Deep Eutectic Solvents (DES) as well as Natural Deep Eutectic Solvents (NaDES) are mixtures of two or more components which are liquid at ambient temperature. They belong to the category of green solvents as they are characterized by low toxicity, they are recyclable and biodegradable. They have a variety of applications, one promising of which is their use as solvents and catalysts in the synthesis of organic compounds. In the context of this PhD thesis, the synthesis and characterization of three different series of NaDES based on choline, betaine and amino acids as well as organic acids was carried out. A total of 20 NaDES were synthesized and comparatively evaluated for their degradability in the synthesis of quinazolinone analogues through a Multicomponent Reactions (MCRs) and the use of ultrasound. NaDES consisting of choline chloride and lactic acid showed higher efficiency and was therefore used in the majority of reactions. With the above methodology, 53 molecules of 2,3-dihydroquinazoline-4(1H)-ones were synthesized, while at the same time the "green" character of each composition was comparatively examined using quantitative indicators and the recycling and reuse of NaDES in these reactions where up to three replicates were performed with success and high yields. In addition, natural deep eutectic solvents (NADES) were also evaluated for their ability to interact with DNA so that they could be used as alternative solvents in biological applications. The activity of both the raw materials, i.e. the natural components that synthesized each NaDES, the 20 synthesized NaDES as well as the natural mixtures were studied and evaluated. From the results obtained, it appeared that the use of NaDES based on choline chloride exhibited a stronger interaction with DNA than those synthesized on the basis of betaine. Finally, selected quinazolinone derivatives were successfully encapsulated in selected biodegradable carriers in order to modify their physicochemical properties, e.g. increasing water solubility. The nanoparticles were characterized structurally by NMR and FT-IR spectroscopy, for their size and ζ-potential by dynamic light scattering (DLS), thermally by TGA and DSC techniques and for their morphology by scanning electron microscopy (SEM). In particular, in this PhD thesis, the encapsulation of the quinazolinone derivatives 4f, 10d in PLA and β-CD matrices was carried out, while for the lead compound 3e three types of cyclodextrins were used (β-CDs, Me-β-CD, HP-β-CD). In addition, the development of a suitable encapsulation methodology with PLA using NaDES solvent was achieved. Finally, a study of the release profile of the molecules was carried out as well as a study and evaluation of the complexes in terms of their interaction with DNA.

Αντικείμενο της διδακτορικής διατριβής αποτέλεσε αρχικά η ανάπτυξη μιας «χημικής βιβλιοθήκης» με νέα συνθετικά ανάλογα της οικογένειας των κιναζολινονών και των ωρονών. Η «χημική βιβλιοθήκη αναπτύχθηκε με σκοπό τη μελέτη της σχέσης δομής-βιολογικής δράσης. Τα δομικά ανάλογα με την ισχυρότερη δράση αξιοποιήθηκαν περεταίρω μέσω του εγκλεισμού τους σε επιλεγμένους νανοφορείς. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή επιτεύχθηκε ο σχεδιασμός, η σύνθεση καθώς και ο χαρακτηρισμός κιναζολινικών αναλόγων και ωρονών, τα περισσότερα από αυτά νέα στην βιβλιογραφία. Οι ενώσεις που συντέθηκαν ταυτοποιήθηκαν μέσω της φασματοσκοπίας πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (1Η και 13C NMR), φασματομετρία μάζας υψηλής ανάλυσης (HR-MS) και φασματοσκοπία υπερύθρου (FT-IR). Συγκεκριμένα, σχεδιάστηκαν πέντε σειρές κιναζολινικών παραγώγων Α, Β, Γ, Δ και Ε. Η Σειρά Α περιλαμβάνει τα ανάλογα της 3-αμινο-2-μεθυλο-6,7 υποκατεστημένων κιναζολινονών τα οποία συντέθηκαν σε δύο στάδια με τη χρήση μικροκυματικής ακτινοβολίας ως μέθοδο φιλικότερη στο περιβάλλον. Η Σειρά Α εμπλουτίστηκε και με τα παράγωγα 2-μεθυλο-3,6,7 υποκατεστημένων κιναζολινονών τροποποιώντας την θέση 3 του κιναζολινικού δακτυλίου με τη χρήση διαμινών. Η Σειρά Β περιλαμβάνει κιναζολινικά παράγωγα βάσεων Schiff με κύριο δομικό συστατικό την παρουσία διπλού δεσμού στη θέση 3 και σχεδιάστηκε ώστε να μελετηθεί η σχέση δομής-βιολογικής δράσης και συγκεκριμένα η παρουσία του διπλού δεσμού. Η σύνθεση των βάσεων Schiff περιλαμβάνει τρία στάδια αρχικά την κυκλοποίηση του ανθρανιλικού οξέος προς κατάλληλης υποκατεστημένης βενζοξαζινόνης. Έπειτα ακολουθεί η προσθήκη ένυδρης υδραζίνης και τέλος η προσθήκη κατάλληλα υποκατεστημένης βενζαλδεΰδης καταλυόμενη από πιπεριδίνη. Η Σειρά Γ περιλαμβάνει αμιδικών κιναζολινικών παραγώγων με κύριο δομικό συστατικό την παρουσία αμιδικής ομάδας στην θέση 3. Η σύνθεση περιλαμβάνει 3 στάδια, αρχικά την κυκλοποίηση του ανθρανιλικού οξέος προς κατάλληλης υποκατεστημένης βενζοξαζινόνης και έπειτα την προσθήκη ένυδρης υδραζίνης προς σχηματισμό των παραγώγων της Σειράς Α με χρήση μικροκυματικής ακτινοβολίας και τέλος την προσθήκη ακέτυλοχλωριδίου για την σύνθεση των παραγώγων της σειράς αυτής. Σημειώνεται ότι το τρίτο στάδιο σύμφωνα με τις βιβλιογραφικές αναφορές εκτελέστηκε με συμβατική θέρμανση αλλά μελετήθηκε και με την εισαγωγή της μικροκυματικής ακτινοβολίας. Οι Σειρές Δ, Ε και ΣΤ περιλαμβάνει την δεύτερη μεγάλη οικογένεια κιναζολινικών παραγώγων των 2,3 διςυποκατεστημένων κιναζολινονών. Πιο συγκεκριμένα οι Σειρές αυτές περιλαμβάνουν κιναζολινικά παράγωγα που συντέθηκαν σε ένα στάδιο μέσω αντίδρασης πολλαπλών συστατικών (MCR) και την χρήση φυσικών βαθέως ευτηκτικών διαλυτών (NADES) ως διαλύτες και καταλύτες των αντιδράσεων αυτών και την χρήση τεχνικών υψηλής ενέργειας για την βελτιστοποίηση της μεθοδολογίας. Η χρήση των NADES επιλέχθηκε ως φιλικότερων προς το περιβάλλον διαλυτών, καθώς ως μη τοξικοί αντικαθιστούν τους τοξικούς οργανικούς διαλύτες ενώ παράλληλα λειτουργούν και ως καταλύτες βελτιώνοντας τις αποδόσεις των τελικών προϊόντων. Σημειώνεται ότι η μεθοδολογία αυτή που αναπτύχθηκε φέρει αρκετά πλεονεκτήματα και λόγω της αντίδρασης MCR όπου δίνεται η δυνατότητα από απλές πρώτες ύλες να παραχθούν χημικές βιβλιοθήκες βιοδραστικών μορίων χωρίς απομόνωση ενδιάμεσων ενώσεων, προσθήκη επιπλεόν αντιδρώντων και διαλυτών κ.α. Πιο συγκεκριμένα, για η Σειρά Δ περιλαμβάνει παράγωγα 2,3 διςυποκατεστημένων κιναζολινονών όπου συντέθηκαν σε ένα στάδιο με προσθήκη ισατοϊκού ανυδρίτη, κατάλληλα υποκατεστημένης ανιλίνης, κατάλληλα υποκατεστημένης βενζαλδεϋδης και NADES ως διαλύτη και καταλύτη της αντίδρασης. Σημειώνεται ότι πέρα από την ανάπτυξη της χημικής βιβλιοθήκης πραγματοποιήθηκε και μελέτη της καταλυτικής δράσης 20 διαφορετικών NADES ώστε να βρεθούν οι βέλτιστες συνθήκες για την μεθοδολογία αυτή. Η Σειρά Ε αντίστοιχα περιλαμβάνει 2,3-διςυποκατεστημένες κιναζολινόνες οι οποίες συντέθηκαν σε ένα στάδιο με την προσθήκη ισατοϊκού ανυδρίτη ένυδρης υδραζίνης και κατάλληλα υποκατεστημένης αλδεΰδης. Για το σχεδιασμό μιας φιλικότερης προς το περιβάλλον μεθοδολογίας και εδώ πραγματοποιήθηκε η προσθήκη κατάλληλου NADES με την χρήση υπερήχων για βελτιστοποίση της μεθοδολογίας. Η Σειρά ΣΤ περιλαμβάνει αντίστοιχα παράγωγα τα οποία συντέθηκαν σε ένα στάδιο με την προσθήκη ισατοϊκού ανυδρίτη, κατάλληλα υποκατεστημένης ανιλίνης, κιναμικού χλωριδίου και επιλεγμένου NADES.Τέλος, η Σειρά Η και Ζ περιλαμβάνει την σειρά των χαλκονών και ωρονών αντίστοιχα. Η σύνθεση επιλεγμένων χαλκονών και ωρονών επιλέχθηκε ώστε να μελετηθεί η σχέση δομής δράσης, καθώς οι ωρόνες έχουν την ικανότητα να αλληλεπιδρούν με το DNA ως παρεμβολείς του DNA. Έτσι κρίθηκε σκόπιμο να δοκιμαστούν και ως προς την πιθανή ικανότητά τους να φωτοδιασπούν το DNA, ως ενδεχόμενοι φωτοευαισθητοποιητές. Αρχικά, η σύνθεση της Σειράς Η περιλαμβάνει την σύνθεση των χαλκονών μέσω αντίδρασης συμπύκνωσης Claisen-Schmidt μεταξύ κατάλληλα υποκατεστημένων υδροξυ-ακετοφαινονών και κατάλληλα υποκατεστημένων βενζαλδεϋδών σε βασικές συνθήκες. Έπειτα ακολουθεί η σύνθεση της Σειράς Η που περιλαμβάνει την οξειδωτική κυκλοποίηση των αντίστοιχων χαλκονών χρησιμοποιώντας οξικό υδράργυρο (ΙΙ) ως οξειδωτικό παράγοντα. Στη συνέχεια για τα κιναζολινικά παράγωγα και τις ωρόνες που συντέθηκαν μελετήθηκε η σχέση δομής και in vitro βιολογικής δράσης. Πιο συγκεκριμένα, τα νέα παράγωγα αξιολογήθηκαν ως προς την ικανότητα να αλληλεπιδρούν με το DNA, την ικανότητα διάσπασης του DNA κάτω από την επίδραση ακτινοβολίας καθώς και της αντιοξειδωτικής τους δράσης μέσω της ικανότητας τους να αλληλεπιδρούν με την ελεύθερη ρίζα DPPH.Από την αξιολόγηση προέκυψαν σημαντικά αποτελέσματα για τη σχέση δομής- βιολογικής δράσης. Ορισμένα από τα παράγωγα παρουσίασαν σημαντική αντιοξειδωτική δράση, πιο συγκεκριμένα τα παράγωγα της Σειράς Α, Δ, Ε που φέρουν υδρόξυ-ομάδα στον κιναζολινικό δακτύλιο φαίνεται να βελτιώνουν σημαντικά την αντιοξειδωτική δράση. Ως προς την μελέτη της αλληλεπίδρασης τους με το DNA, τα υπολογιστικά αποτελέσματα και τα αποτελέσματα της τιτλοδότησης των μορίων και την αλληλεπίδρασης τους με DNA θύμου αδένα (CT-DNA) φάνηκαν να είναι ανάλογα σημειώνοντας ότι τα κιναζολινικά ανάλογα παρουσιάζουν εξωτερική αλληλεπίδραση στην μικκρή ή την μεγάλη αύλακα του DNA. Ως προς τη σχέση δομής-δράσης φαίνεται ότι οι υποκαταστάτες αλογονο-ομάδων, νιτρό-ομάδων, υδρόξυ-ομάδων, μεθόξυ ομάδων σε ορισμένα παράγωγα να είναι καθοριστικοί για την αλληλεπίδραση τους με το DNA καθώς όπως φάνηκε και από τα υπολογιστικά δεδομένα εμφάνιζαν ισχυρότερη αλληλεπίδραση σχηματίζοντας δεσμούς υδρογόνου. Επίσης, τα κιναζολινικά παράγωγα μελετήθηκαν και αξιολογήθηκαν ως προς την ικανότητα τους να φωτοδιασπούν το DNA ως ενδεχόμενοι φωτοευαισθητοποιητές για την χρήση τους σε θεραπείες όπως καρκίνου, δερματικές παθήσεις (π.χ. ψωρίαση, ακμή) καθώς και ως αντιμικροβιακά. Συγκεκριμένα μελετήθηκαν τα κιναζολινικά παράγωγα ως προς τις θέσεις 3, 6 και των ρόλο των υποκαταστατών σε αυτές τις θέσεις. Συγκεριμένα, μελετήθηκε η παρουσία και η απουσία αμινο-ομάδας στη θέση 3 καθώς και η επιμήκυνση της αλειφατικής ομάδας στη θέση αυτή, όπου φάνηκε καθοριστικός παράγοντας για την δράση. Ακόμη υποκαταστάτες στη θέση 6 όπως αλογονο-ομάδα, νίτρο ομάδα, υδρόξυ ομάδα παρουσιάζουν υψηλά ποσοστά φωτοδιάσπασης. Για τις σειρές των διϋδροκιναζολινονών σημαντικός δομικός παράγοντας αποτέλεσε η ύπαρξη αλογόνων-ομάδων και νιτρο-ομάδων ως υποκαταστάτες των αρωματικών δακτυλίων της θέσης 2 και 3 του κιναζολινικού δακτυλίου. Παρακάτω παρουσιάζονται ορισμένα παράγωγα που μπορούν να αποτελέσουν μόρια οδηγοί για την αλληλεπίδρασή τους και τον τρόπο δράσης τους με το DNA. Παρακάτω παρουσιάζονται ορισμένα από τα παράγωγα αυτά. Παράλληλα, χρησιμοποιήθηκαν πράσινοι διαλύτες και συγκεκριμένα φυσικοί βαθέως ευτηκτικοί διαλύτες για να βελτιώσουν τις αντιδράσεις σύνθεσης δίνοντας ένα πιο πράσινο χαρακτήρα στις αντιδράσεις αυτές. Οι Βαθέως Ευτηκτικοί Διαλύτες (DES) καθώς και οι Φυσικοί Βαθέως Ευτηκτικοί Διαλύτες (NaDES) είναι μίγματα δύο ή περισσότερων συστατικών τα οποία είναι υγρά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Ανήκουν στην κατηγορία των πράσινων διαλυτών καθώς χαρακτηρίζονται από χαμηλή τοξικότητα, είναι ανακυκλώσιμοι και βιοαποικοδομήσιμοι. Έχουν ποικίλες εφαρμογές, μία πολλά υποσχόμενη εξ αυτών είναι η χρήση τους ως διαλύτες και καταλύτες στη σύνθεση οργανικών ενώσεων. Στο πλαίσιο της παρούσας διδακτορικής διατριβής πραγματοποιήθηκε η σύνθεση και ο χαρακτηρισμός τριών διαφορετικών σειρών NaDES με βάση την χολίνη, την βεταΐνη και αμινοξέα καθώς και οργανικά οξέα. Πραγματοποιήθηκε συνολικά η σύνθεση 20 NaDES και αξιολογήθηκαν συγκριτικά ως προς την απολεσματικότητά τους κατά την σύνθεση κιναζολινικών αναλόγων μέσω μιας αντίδρασης πολλαπλών συστατικών (Μulticomponent Reactions, MCRs) και χρήση υπερήχων. Υψηλότερη αποτελεσματικότητα έδειξε το NaDES που αποτελείται από χλωριούχο χολίνη και το γαλακτικό οξύ και για αυτό χρησιμοποιήθηκε στην πλειονότητα των αντιδράσεων. Με την παραπάνω μεθοδολογία συντέθηκαν 53 μόρια 2,3-διυδροκιναζολιν-4(1H)-ονών, ενώ παράλληλα εξετάστηκε συγκριτικά ο «πράσινος» χαρακτήρας της εκάστοτε σύνθεσης με χρήση ποσοτικών δεικτών και μελετήθηκε και η ανακύκλωση και η επαναχρησιμοποίηση των NaDES στις αντιδράσεις αυτές όπου εκτελέστηκαν έως και τρεις επαναλήψεις με επιτυχία και υψηλές αποδόσεις. Επιπλέον, οι φυσικοί βαθέως ευτηκτικοί διαλύτες (NADES) αξιολογήθηκαν και ως προς την ικανότητά τους να αλληλεπιδρούν με το DNA ώστε να μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως εναλλακτικοί διαλύτες σε βιολογικές εφαρμογές. Μελετήθηκε και αξιολογήθηκε η δράση τόσο των πρώτων υλών, δηλαδή των φυσικών συστατικών που αποτελείται κάθε NaDES, τα 20 συντιθέμενα NaDES καθώς και τα φυσικά μίγματα. Από τα αποτελέσματα που πάρθηκαν φάνηκε ότι η χρήση NaDES με βάση την χλωριούχο χολίνη εμφάνιζαν ισχυρότερη αλληλεπίδραση σε σχέση με εκείνα που συντέθηκαν με βάση την βεταϊνη.Τέλος, επιλεγμένα κιναζολινικά παράγωγα εγκλείστηκαν με επιτυχία σε επιλεγμένους βιοδιασπώμενους φορείς με σκοπό να τροποποιηθούν οι φυσικοχημικές τους ιδιότητες π.χ. αύξηση της υδατοδιαλυτότητας. Τα νανοσωματίδια χαρακτηρίστηκαν δομικά με φασματοσκοπία NMR και FT-IR, ως προς το μέγεθός τους και το ζ-δυναμικό με τη δυναμική σκέδαση φωτός (DLS), θερμικά με τις τεχνικές TGA και DSC και για την μορφολογία τους με ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης (SEM). Ειδικότερα, στην παρούσα διδακτορική εργασία πραγματοποιήθηκε ο εγκλεισμός των κιναζολινικών παραγώγων 4f, 10d σε μήτρες PLA και β-CD, ενώ για την ένωση οδηγό 3e χρησιμοποιήθηκαν τρία είδη κυκκλοδεξτρινών (β-CDs, Me-β-CD, HP-β-CD). Επιπλέον, επιτεύχθηκε η ανάπτυξη κατάλληλης μεθοδολογίας εγκλεισμού με PLA χρησιμοποιώντας διαύτη NaDES. Τέλος, πραγματοποιήθηκε μελέτη του προφίλ απελευθέρωσης των μορίων καθώς και μελέτη και αξιολόγηση των συμπλόκων ως προς την αλληλεπίδρασή τους με το DNA.