Delineation of the mechanisms that promote the tolerogenic properties of dendritic cells in autoimmune diseases

Abstract

Autoimmune diseases develop upon aberrant activation of lymphocytes mainly due to failure of self-tolerance mechanisms. Both innate and adaptive immune system over-activation contribute to autoimmunity and tissue inflammation. Rheumatoid arthritis (RA) is considered as an autoimmune disease against post-translationally modified proteins, characterized by uncontrolled inflammation. Genetic data have revealed CD4+ lymphocytes and dendritic cells (DCs) as important contributors to the breach of immunologic tolerance and development of autoimmunity in RA patients. Currently biologic therapies (bDMARDs) applied in clinical practice, mainly target the inflammatory process, such as anti-tumor necrosis factor α (TNF-α)- agents, Interleukin 6 receptor (IL-6R) and JAK-STATs inhibitors, or target the adaptive immune response via B-cell depletion (anti- CD20 antibodies) and T-cell co-stimulation molecule blockade (CTLA4-Ig). Nevertheless, data from registries and cohort studies have shown that in clinical practice, 50-60% of RA patients starting a bDMARD will stop treatment due to inefficacy or toxicity in the long-term, while clinical response, remission or low disease activity, is unpredictable and is achieved by 20-40% of patients. Development of predictive markers of response for everyday clinical practice will be an important step in optimizing the treatment of autoimmune diseases. DCs drive the immune responses through their crucial role in the antigen presentation process. The ability of DCs to modulate T-cell responses has made them an interesting target of study for the immunotherapy of autoimmune diseases. Until now, human DC-based therapeutic strategies have mainly relied on ex vivo generated DCs differentiated from peripheral blood (PB) monocytes and have demonstrated limited efficacy in clinical trials. Thus, identifying alternative therapeutic strategies that aim at manipulating human DCs towards an immunoregulatory phenotype may yield improved treatments. Strategies to manipulate DCs to exploit their immunoregulatory potential are currently under investigation. Cytotoxic T lymphocyte antigen 4 (CTLA4) is a negative costimulatory molecule expressed on the T cell membrane and its significant immunoregulatory role in the context of autoimmune diseases is confirmed through the clinical benefit upon CTLA4-Ig treatment (abatacept) in patients with RA. Several studies support that CTLA4 delivers reverse signals on DCs, thus reducing their inflammatory function and enhancing their tolerogenic phenotype. Nevertheless, the molecular mechanisms that are involved in the induction of the tolerogenic phenotype of CTLA4-mediated effects on DCs, have not been extensively studied. In this study we aimed to identify biomarkers that predict clinical responses to etanercept and abatacept, based on either demographic and clinical characteristics or a detailed immunological profiling of PB of RA patients, respectively. We assessed the levels of pathogenic and regulatory cell populations, as well as the sera transcriptome of abatacept-treated RA patients at baseline, on 3rd and 6th month after treatment initiation in order identify a signature of cell populations and sera proteins, that are associated with clinical responses to abatacept. Furthermore, we used CTLA4-Ig as a tool to generate in vitro tolerogenic DCs (tolDCs) and we investigated the intracellular pathways that are implicated in the induction of the tolerogenic phenotype in CTLA4-treated DCs. To address this, human monocytes from healthy donors were isolated and differentiated into DCs. DCs were cultured with CTLA4-Ig and subjected to genome-wide transcriptomics. The anti-inflammatory function of DCs was further assessed. In the observational study, we showed that approximately half of the patients starting etanercept discontinued within the first year of therapy. We observed that treatment inefficacy, which was the most frequent cause of therapy disruption, was associated with female gender, obesity and higher baseline swollen joint count. Moreover, we highlighted that the groups of patients that improved disease activity were overrepresented by males, patients had shorter disease duration and better functional status. Next, focusing on the immunological studies, we found a strong association of high levels of T helper 1 cells (Th1), myeloid- derived suppressor cells (MDSCs) and DCs with a better response to abatacept treatment at 6 months. Moreover, proteomics analysis revealed 10 amongst 303 proteins in peripheral serum to have differential expression according to clinical responses at 6 months. Interestingly, a composite index based on the above described cellular and protein markers showed a high discriminative ability to predict response to abatacept. Furthermore, we revealed that CTLA4-Ig-treated DCs demonstrated significantly upregulated transcriptional levels of anti-inflammatory gene IL10. However, the expression of inflammatory cytokines IL6 and TNFα were decreased, accompanied with reduced T cell proliferation in co-culture experiments, highlighting the immunosuppressive properties of CTLA4-Ig-treated DCs. Interestingly, transcriptomic analysis revealed 1270 differentially expressed genes in CTLA4-mediated tolDCs, the majority of them participated in metabolic processes, specifically in OXPHOS pathway and mitochondrial function. Notably, we confirmed that tolDCs had lower basal OXPHOS and decreased ATP production via Seahorse assays. Furthermore, expression of phosphorylated mammalian target of rapamycin (mTOR) and AKT1, central regulators of metabolism, were increased in CTLA4-mediated tolDCs. Mechanistically, we showed that mTOR controlled the expression of the transcription factor Sp1, which enhanced the expression of anti-inflammatory gene IL10, thus contributing to the regulatory function of CTLA4-mediated tolDCs.

Οι αυτοάνοσες ασθένειες αναπτύσσονται λόγω απορρύθμισης της λειτουργίας των λεμφοκυττάρων, κυρίως σε περιπτώσεις αστοχίας ρυθμιστικών μηχανισμών ανοσολογικής ανοχής. Η υπερ-ενεργοποίηση τόσο του έμφυτου όσο και του επίκτητου ανοσοποιητικού συστήματος συμβάλλουν στην αυτοανοσία και την ιστική φλεγμονή. Η ρευματοειδής αρθρίτιδα (ΡΑ) θεωρείται ως μια αυτοάνοση ασθένεια που χαρακτηρίζεται από αυτοαντισώματα έναντι μετα-μεταφραστικά τροποποιημένων πρωτεϊνών, η οποία οδηγεί σε ανεξέλεγκτη φλεγμονή. Μελέτες έχουν αναδείξει τον σημαντικό ρόλο των CD4+ λεμφοκυττάρων και των δενδριτικών κυττάρων (DCs) στην διάσπαση της περιφερικής ανοσολογικής ανοχής και τελικά την εξέλιξη της νόσου σε ασθενείς με ΡΑ. Οι βιολογικοί παράγοντες που εφαρμόζονται στην κλινική πράξη, στοχεύουν κυρίως στον περιορισμό της φλεγμονής, όπως αναστολείς των μορίων TNF-α, IL-6R και αναστολείς του JAK-STAT μονοπατιού, είτε παράγοντες που απαλείφουν τα Β κύτταρα (αντισώματα έναντι του CD20) ή εμποδίζουν τη συν-ενεργοποίηση των Τ κυττάρων (CTLA4-Ig). Παρόλο αυτά, δεδομένα από μητρώα ασθενών έχουν δείξει οτι το 50-60% των ασθενών που λαμβάνουν βιολογικό παράγοντα θα σταματήσουν τη θεραπεία εξαιτίας της μη αποτελεσματικότητας ή της τοξικότητας του, ενώ η κλινική ανταπόκριση, ύφεση ή χαμηλή ενεργότητα της νόσου, είναι απρόβλεπτη και επιτυγχάνεται στο 20-40% των ασθενών. Η ανάπτυξη προγνωστικών δεικτών απόκρισης σε θεραπείες για τη καθημερινή κλινική πράξη θα είναι ένα ακόμη σημαντικό βήμα στη βελτιστοποίηση της θεραπείας των αυτοάνοσων νοσημάτων. Τα DCs καθορίζουν τις ανοσολογικές αποκρίσεις μέσω του σημαντικού τους ρόλου στη διαδικασία της αντιγονοπαρουσίασης. Η ικανότητα των DCs να ρυθμίζουν τις αποκρίσεις των Τ κυττάρων τα καθιστά έναν ενδιαφέρον στόχο μελέτης για την ανοσοθεραπεία των αυτοάνοσων νοσημάτων. Οι μέχρι τώρα θεραπευτικές στρατηγικές βασίζονται κυρίως σε ex vivo τροποποιημένα DCs που προέρχονται από την διαφοροποίηση των μονοκυττάρων της περιφέρειας, και έχουν επιδείξει περιορισμένη αποτελεσματικότητα σε κλινικές δοκιμές. Έτσι, η διερεύνηση εναλλακτικών θεραπειών που στοχεύουν στην ανοσορρυθμιστική δράση των DCs, αποτελεί ένα σημαντικό βήμα στη βελτιστοποίηση της θεραπευτικής εφαρμογής τους.Θεραπευτικές στρατηγικές που στοχεύουν στην ανοσορρυθμιστική δράση των DCs βρίσκονται υπό διερεύνηση. Το αντιγόνο Τ-κυτταροτοξικών λεμφοκυττάρων-4 (CTLA4) είναι ένα αρνητικό συνδιεγερτικό μόριο που εκφράζεται στα Τ λεμφοκύτταρα και ο σημαντικός ανοσορρυθμιστικός ρόλος του, στο πλαίσιο των αυτοάνοσων νοσημάτων, επιβεβαιώνεται με την απόκριση των ασθενών με ΡΑ σε θεραπεία με CTLA4-Ig (abatacept). Αρκετές μελέτες υποστηρίζουν ότι η σηματοδότηση μέσω του μορίου CTLA4 ρυθμίζει τον φαινότυπο των DCs, περιορίζοντας την φλεγμονώδη δράση τους και επάγοντας την ανοχή. Παρόλο αυτά, ο λεπτομερής μηχανισμός καθώς και τα ενδοκυττάρια μονοπάτια που εμπλέκονται στην επαγωγή της ανοχής των DCs μέσω της σηματοδότησης του CTLA4 δεν έχουν μελετηθεί εκτενώς. Στην παρούσα μελέτη διερευνήσαμε για βιοδείκτες που προβλέπουν κλινικές αποκρίσεις σε βιολογικές θεραπείες etanercept και abatacept, βάσει δημογραφικών και κλινικών χαρακτηριστικών ή ανοσοφαινοτυπικής ανάλυσης περιφερικού αίματος των ασθενών με ΡΑ, αντίστοιχα. Χαρακτηρίσαμε τους παθογονικούς και ρυθμιστικούς πληθυσμούς του περιφερικού αίματος καθώς και τις πρωτεΐνες του ορού των ασθενών πριν την έναρξη της θεραπείας, στους 3 και 6 μήνες υπό abatacept, με σκοπό να ταυτοποιήσουμε κυτταρικούς πληθυσμούς και πρωτεΐνες στον όρο που σχετίζονται με κλινική απάντηση. Επιπρόσθετα, σε in vitro πειράματα χρησιμοποιήσαμε το CTLA4-Ig ως εργαλείο για να επάγουμε ρυθμιστικά DCs και διερευνήσαμε τα ενδοκυττάρια μοριακά μονοπάτια που εμπλέκονται στην επαγωγή της ανοσοκατασταλτικής δράσης των DCs μέσω της ενεργοποίησης του CTLA4 μονοπατιού. Για τον σκοπό αυτό, ανθρώπινα μονοκύτταρα από υγιείς δότες απομονώθηκαν και διαφοροποιήθηκαν σε DCs. Τα DCs τα οποία έλαβαν in vitro CTLA4-Ig,υποβλήθηκαν σε ανάλυση μεταγραφώματος (RNAseq) και μελετήθηκε περαιτέρω η αντιφλεγμονώδη δράση τους. Στη μελέτη παρατήρησης, δείξαμε ότι περίπου οι μισοί από τους ασθενείς που ξεκίνησαν etanercept διέκοψαν τη θεραπεία εντός του πρώτου έτους. Αναδείξαμε ότι η μη αποτελεσματικότητα της θεραπείας, η οποία ήταν η πιο συχνή αιτία διακοπής, συσχετίζεται με το γυναικείο φύλο, την παχυσαρκία και τον υψηλότερο αριθμό διογκωμένων αρθρώσεων πριν την έναρξη της θεραπείας. Επιπλέον, αποκαλύψαμε ότι οι ομάδες ασθενών, στις οποίες επιτεύχθηκε μειωμένη ενεργότητα της νόσου, υπερεκπροσωπούνταν από άνδρες, οι ασθενείς είχαν μικρότερη διάρκεια της νόσου και καλύτερη λειτουργική κατάσταση. Στη συνέχεια, εστιάζοντας στις ανοσολογικές μελέτες αναδείξαμε μια ισχυρή συσχέτιση των υψηλών επιπέδων Th1, MDSCs και DCs με καλύτερη ανταπόκριση στη θεραπεία με abatacept στους 6 μήνες. Επιπλέον, η πρωτεομική ανάλυση αποκάλυψε ότι 10 από τις 303 πρωτεΐνες στον ορό είχαν διαφορά στην έκφραση με βάση τις κλινικές αποκρίσεις. Είναι ενδιαφέρον ότι ο συνδυασμός των παραπάνω περιγραφόμενων κυτταρικών πληθυσμών και πρωτεϊνών του ορού έδειξε υψηλή ικανότητα να προβλέπει την απόκριση στο abatacept. Λειτουργικά, δείξαμε ότι τα DCs που καλλιεργήθηκαν παρουσία του CTLA4-Ig είχαν σημαντικά αυξημένα μεταγραφικά επίπεδα του αντιφλεγμονώδους γονιδίου IL10. Ωστόσο, η έκφραση των φλεγμονωδών κυτταροκινών IL6 και TNFα μειώθηκε, συνοδευόμενη από μειωμένο πολλαπλασιασμό Τ-λεμφοκυττάρων σε πειράματα συν-καλλιέργειας, υπογραμμίζοντας τις ανοσοκατασταλτικές ιδιότητες των CTLA4-treated DCs. Είναι ενδιαφέρον ότι η μεταγραφική ανάλυση(RNA-seq) αποκάλυψε την διαφορετική έκφραση 1270 γονιδίων στα CTLA4-mediated tolDCs, η πλειοψηφία των οποίων συμμετείχε σε μεταβολικές διεργασίες, όπως στην οξειδωτική φωσφορυλίωση (OXPHOS) και στη μιτοχονδριακή λειτουργία. Συγκεκριμένα, επιβεβαιώσαμε ότι τα tolDCs είχαν χαμηλότερη OXPHOS και μειωμένη παραγωγή μορίων ATP μέσω Seahorse πειραμάτων. Επιπλέον, η φωσφορυλιωμένη έκφραση του mTOR και AKT1, βασικών ρυθμιστών του μεταβολισμού, ήταν αυξημένη στα tolDCs. Μηχανιστικά, δείξαμε ότι το μόριο mTOR ελέγχει την έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα Sp1, ο οποίος επάγει την έκφραση του αντιφλεγμονώδους γονιδίου IL10, συμβάλλοντας έτσι στη ρυθμιστική λειτουργία των CTLA4-mediated tolDCs.